富含亚油酸-神经酰胺的保湿剂在特应性皮炎鼠模型中的作用研究

王孝盼 权 晟 陈利红 郑 捷

皮肤屏障破坏和继发炎症反应是特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)发生的两个关键环节[1]。部分特应性皮炎患者的丝聚蛋白(Filaggrin，FLG)基因缺陷或脂质代谢相关的基因异常导致皮肤屏障破坏[2,3]，存在于表皮外的物质如各种微生物作为变应原更易与皮肤中丰富的免疫活性细胞接触，诱导Th2型为主的炎症反应[4,5]。Th2细胞通过分泌细胞因子如IL-4和IL-13，抑制皮肤屏障功能结构蛋白的基因表达，例如丝聚蛋白、兜甲蛋白等；抑制表皮脂质分泌；下调抗菌肽LL-37，hBD2等进一步损害屏障[6-8]。因此，皮损部位皮肤屏障的破坏和皮肤免疫炎症反应相互作用形成恶性循坏，AD的特征性临床症状得以持续存在甚至加重。

保湿剂已广泛用于AD的基础治疗，应用保湿剂可以显著减轻皮损程度甚至在痊愈后持续使用可以降低疾病复发率[9,10]。保湿剂通过增加皮肤角质层的水合达到修复皮肤屏障的作用，因此，又被称为“皮肤屏障修护剂”。补充含有适当比例脂肪酸、神经酰胺、胆固醇的保湿剂具有促进皮肤通透屏障修复的作用[11]。保湿剂是AD的基础治疗，其机制主要是对AD受损的屏障进行修复，而外用保湿剂调节皮肤炎症作用机制尚未完全阐明。

我们推测富含LA-Cer的保湿剂兼具修复皮肤屏障和抗炎作用，从而抑制炎症和皮肤屏障破坏间的恶性循环。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备 卡泊三醇(calcipotriol/MC903)购自英国Tocris公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；Eastep® Super Total RNA Extraction Kit购自上海Promega公司；逆转录试剂盒购自日本Takara公司；SYBR Green PCR Master Mix购自美国Roche公司。Coneometer CM825购自德国CK公司，富含亚油酸-神经酰胺的保湿剂玉泽皮肤屏障修护精华乳由上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科与上海家化联合股份有限公司联合研制。

1.2 实验动物 均购自Jackson Laboratory公司，6～8周龄雌性BALB/c小鼠。

1.3 分组 实验动物18只，随机分为疾病组，治疗组，对照组(EtOH)。疾病组鼠耳每天一次均匀涂抹2 nmol卡泊三醇溶液14天；治疗组以卡泊三醇诱导AD模型同时，每天予两次涂抹富含LA-Cer的保湿剂于鼠耳；对照组鼠耳每天一次涂抹20 μL无水乙醇14天。

1.4 RT-PCR 采用Trizol和promega总RNA抽提试剂盒提取鼠耳皮肤组织总RNA，Takara逆转录试剂盒逆转获得cDNA后，采用SYBR为荧光标记物的RT-PCR检测皮肤组织中TSLP，IL-4，IL-10等的表达。结果表示为相对管家基因互达量(2-△ct)，其中ct为循环值。引物序列参考β-actin-F:TGTCCACCTTCCAGCAGATGT,β-actin-R: AGCTCAGTAACAGT-CCGCCTAG; TSLP-F GCAAATCGAGGACTGTGAG-AGC, TSLP-R: TGAGGGCTTCTCTTGTTCTCCG; IL-4-F: ATCATCGGCATTTTGAACGAGGTC, IL-4-R: ACCTTGGAAGCCCTACAGACGA; IL-33-F: CTACTGCATGAGACTCCGTTCTG, IL-33-R: AGAATCCCGTGGATAGGCAGAG; IL-10-F: TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA, IL-10-R: TCAGACAAGGCTTGGCAACCCA; IL-1β-F: TGGACCTTCCAGGATGAGGACA, IL-1β-R: GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG; IFNγ-F: CAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGG, IFNγ-R: TTTCCGCTTCCTGAGGCTGGAT; FLG-F: ACAGGTGGTCATGGCAGAAGCT, FLG-R: CTCCATCTCAGATACCAGGTCC.由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 统计学方法 实验数据用Graph Prism version 7.0 统计分析，表示为均数±标准差，两组间采用非成对t检验(Unpaired t test)比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 富含LA-Cer的保湿剂对卡泊三醇诱导AD表型的影响 卡泊三醇涂抹鼠耳后出现红肿脱屑，造模成功。与疾病组比较，治疗组红肿脱屑明显减轻(图1a)。治疗组病理HE染色切片显示表皮厚度较疾病组明显减轻，与对照组比较无差异(图1b)。疾病组鼠耳厚度(0.510±0.035)cm较对照组(0.197±0.009)cm均增加，治疗组(0.375±0.015)cm较疾病组明显变薄(P<0.0001)，与对照组比较仍增厚(图1c)。在第7天已经出现三组鼠耳厚度差异，第14天三组鼠耳厚度差异更加明显(图1d)。

2.2 富含LA-Cer的保湿剂对卡泊三醇诱导的AD样皮损相关炎症因子的影响 荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测对照组，疾病组，治疗组鼠耳皮肤组织中TSLP，IL-4，IL-10，IL-1β，IL-33，IFNγ的表达。与对照组比较，疾病组皮肤组织中TSLP，IL-4，IL-10，IL-1β， IFNγ表达均增高(P<0.05)，IL-33有升高趋势 。与疾病组比较，治疗组皮肤组织中TSLP，IL-4，IL-1β表达降低，TSLP，IL-1β表达的下降有统计学意义(P<0.05)。而调节性的细胞因子IL-10的表达在疾病组和治疗组未见明显差异(图2)。

2.3 富含LA-Cer的保湿剂对卡泊三醇诱导的AD皮肤屏障的影响 疾病组皮损内FLG表达较对照组降低，治疗组与疾病组比较FLG表达升高(P=0.1359)(图3a)。疾病组鼠耳皮肤含水量(6.750±1.258)au明显低于对照组(39.250±6.130)au(P<0.0001)。与疾病组比较，治疗组皮肤含水量(22.500±2.081)au恢复(P<0.0001)(图3b)。

1a：皮损严重程度；1b：鼠耳组织病理(HE,×100)；1c：鼠耳厚度变化；1d：第7、14天鼠耳厚度比较。数据显示平均值±标准差(n=6)，***P<0.001 ****P<0.0001

图1 保湿剂对AD样皮损表型的影响

2a：TSLP表达；2b：IL-4表达，IFNr表达；2c：IL-1β表达，IL-33表达，IL-10表达。数据显示平均值±标准差(n=6)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图2 保湿剂对AD样皮损内相关炎症因子mRNA表达的影响

3a：FLG mRNA的表达；3b：皮肤含水量的变化。数据显示平均值±标准差(n=6)，*P<0.05，****P<0.0001

图3 保湿剂对AD屏障的影响

3 讨论

保湿剂应用于轻度AD可以显著改善皮肤水含量，减轻疾病严重程度，并减少AD复发的频率和强度[9，12，13]，保湿剂的作用主要在于修复皮肤屏障。但部分保湿剂可能会损害皮肤屏障，引起皮肤慢性炎症反应[14]。该研究发现富含LA-Cer的保湿剂对皮肤屏障修复和炎症控制均有益。AD皮损长链神经酰胺、脂肪酸的含量均降低[21]，出现屏障破坏。卡泊三醇涂抹鼠耳后皮肤屏障破坏，皮肤干燥。富含LA-Cer的保湿剂明显增加皮肤水含量，另一方面通过补充皮损局部缺失的神经酰胺、亚油酸维持角质层脂质平衡，补充不饱和脂肪酸可能通过刺激PPARr增加内源性脂质合成[22]，调动机体自身修复屏障。

皮损处Th1和Th2失衡，TSLP、IL-4/IL-13以及IFNγ等细胞因子表达增强是AD重要免疫学特征[15，16]。卡泊三醇作为维生素D的衍生物与受体结合后，刺激角质形成细胞分泌TSLP，活化Th2细胞分泌IL-4/IL-13，诱导原始T细胞向Th2细胞分化[15，17]。卡泊三醇促进皮肤中TSLP，IL-4，IL-1β，IL-33，IL-10，IFNγ表达[18]。研究显示外用富含LA-Cer的保湿剂降低卡泊三醇诱导的AD鼠模型皮肤TSLP、IL-4和IL-1β表达，外用富含LA-Cer的保湿剂具有抑制AD中Th2细胞因子的作用，还抑制炎症共同通路的炎症因子IL-1β。Th1型细胞因子IFNγ和调节性细胞因子IL-10皮损局部表达未见明显降低，卡泊三醇诱导的AD鼠模型中皮损主要由Th2类细胞因子高表达导致，猜想外用保湿剂后，皮损严重程度变化趋势最相关的是Th2类细胞因子表达变化。

TSLP、IL-4和IFNγ有抑制角质细胞结构蛋白表达，破坏皮肤屏障的作用。阻断TSLP，IL-4信号通路，FLG的表达升高，皮肤屏障修复[19]。研究中观察到外用富含LA-Cer的保湿剂抑制TSLP，IL-4表达，促进FLG的表达。猜测外用富含LA-Cer的保湿剂抑制特应性皮炎样炎症，促进皮肤屏障的修复,阻断“由外至内，再到外”的循环，该循环解释了AD屏障相关遗传异常在外界因素刺激下易发生下游炎症，产生的Th2类细胞因子反过来破坏渗透屏障功能，加重AD的机制[20]。所以，皮肤屏障的修复隔绝外源性刺激物或者过敏源来减轻皮肤炎症反应，两者形成良性循环。

丝聚蛋白(flaggrin，FLG)基因突变是导致AD患者皮肤屏障破坏的重要因素，AD患者皮损与非皮损区FLG表达均较正常人低[6，23]。卡泊三醇能抑制FLG表达，该研究结果显示外用富含LA-Cer的保湿剂可能具有促进FLG表达，促进角质细胞分化，内源性修复皮肤屏障的作用。

综上，我们在AD鼠模型上研究富含LA-Cer的保湿剂对特应性皮炎的影响，结果显示外用富含LA-Cer的保湿剂阻断炎症和屏障破坏的恶性循环，具有抑制炎症和修复屏障的双重作用，从而改善特应性皮炎的症状。具体通路机制仍待于进一步探究。