高效快速测定果汁饮料中橙汁含量的方法研究

2019-11-14张克贤孙勇民黄艳玲张轶斌

食品研究与开发 2019年21期

张克贤，孙勇民，黄艳玲，张轶斌

（天津现代职业技术学院，天津300300）

市场在售含果汁产品是果汁与其它原料和水的调和物。果汁一般用成熟的水果为原料经过物理方法如压榨、离心等得到的汁液状产品，称其为纯果汁或100%果汁[1]。如橙汁饮料是由纯橙汁加入了糖、甜味剂、酸味料、香料、水等成分。纯橙汁加入的量值决定了该产品的质量[2-5]，因此需要建立方便准确的检测方法，对果汁类产品进行产品质量控制[6-8]。

GB/T 16771-1997《橙、柑、橘汁及其饮料中果汁含量的测定》国家标准，采用的果汁含量的测定方法较复杂并且花费时间较长，它通过测定纯果汁或者含果汁饮料中可溶性固形物、钾、总磷、氨基酸态氮、L-脯氨酸、总D-柠檬酸、总黄酮共7 种组分的实测值计算果汁含量[9-12]。

近年来，国内外资料发表了对柑橘等果实和果汁中类黄酮的成分进行了较详细的分析研究[13-15]。特别是光电二极管阵列检测器高效液相色谱仪和高效液相色谱与质谱联用仪等仪器测定柑橘果实中类黄酮的成分同时能够实现定性和定量[16-19]，例如高效液相色谱法同时测定柑橘果实中柚皮素-7-β 芸香糖苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香风草苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黄酮、川皮苷和桔黄酮10 种类黄酮并且分别对各个组分定性和定量。类黄酮成分是柑橘果实及其压榨液中固有的成分，其具有量值稳定性[20-22]。在调和果汁产品时其与纯果汁加入量相关，其他成分如糖、甜味剂、酸味料、香料、水等成分可以调和不具有量值稳定性。由于类黄酮成分可以进行分离、定性和定量，因此通过光电二极管阵列检测器高效液相色谱仪测定果汁饮料中橙汁含量成为可能。

本试验用光电二极管阵列检测器高效液相色谱仪测定纯橙汁中类黄酮成分之一新橙皮苷，外标法定量。配制不同含量纯橙汁的果汁饮料，测定新橙皮苷含量，建立橙汁含量计算公式。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

纯橙汁：天津山海关饮料有限公司提供。

新橙皮苷（纯度98%）：北京百灵威科技有限公司；乙腈、冰乙酸、甲醇（均为色谱纯）：天津星马克科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AD 型岛津高效液相色谱仪（带有Essentia SIL-16 型二极管阵列检测器，SPD-M20A 型自动进样器，二元泵，岛津Shim-Pak GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 um）反相色谱柱和LabSolutions Essentia 工作站）：日本岛津株式会社；QP-01 型流动相过滤装置：天津津腾科技有限公司；0.45 μm 水型和溶剂型滤膜：北京海成世洁过滤器材有限公司；KQ-100VDV 型双频数控超声波清洗器：江苏省昆山市超生仪器有限公司；[0.45μm（水系）和0.45 μm（有机系）]针筒式滤膜过滤器：天津市精拓仪器科技有限公司；注射器：郑州康佳医疗器械有限公司；5804r 型高速离心机：德国艾本德公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

用精度0.1 mg 的电子天平称取新橙皮苷0.025 5 g于50.00 mL 容量瓶中加入甲醇溶解并定容。该定容物为500 mg/L 的新橙皮苷储备液，根据标准曲线需要逐级稀释成 5、10、15、20 mg/L 不同浓度的使用液。

1.3.2 标准曲线的绘制

将新橙皮苷储备液进行不同浓度梯度稀释成使用液并进行过滤，在相同条件下进行色谱分析，以新橙皮苷标准品浓度为横坐标，以浓度对应峰面积为纵坐标作标准曲线，得到回归方程。未知样经过色谱分析，通过峰面积利用标准曲线求出浓度。

1.3.3 样品制备

将纯橙汁用超纯水配成10%～80%样品分别移取25 mL 于50 mL 容量瓶中用乙腈定容成50 mL，同样配制原液。经超声脱气后移取5 mL～7 mL 于10 mL 离心试管中，离心5 min，取上层清液经0.45 μm 针筒式滤膜过滤器过滤后，备用。

1.3.4 仪器条件确定

优化后的色谱条件为：以岛津Shim-Pak GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）反相色谱柱为分析柱，0.2%乙酸水溶液和乙腈作为流动相，流速为1.0 mL/min，进样30 μL，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1，柱温40 ℃，DAD 检测器在190 nm～800 nm 检测新橙皮苷化合物，色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure for mobile phase

图1 标样新橙皮苷HPLC 色谱图Fig.1 Chromatogram of standard new hesperidin HPLC

1.3.5 标样新橙皮苷的光谱图

将制备的标样储备液按照仪器条件进行扫描和检测，利用二极管检测器在190 nm～800 nm 范围的检测功能，得到紫外-可见光光谱图，显示各个波长吸收峰。

1.4 橙汁含量计算

原果汁纯品进样30 μL，得到原果汁纯品的新橙皮苷HPLC 峰面积，记为S纯，根据标准曲线计算出原果汁中的新橙皮苷含量C纯。利用同一批次原果汁纯品配置的浓度为 10%、20%、30%、40%、50 %、60 %的橙汁样品，依次进样30 μL，分别得到各个配制不同浓度样品的 HPLC 峰面积 S10、S20、S30、S40、S50、S60，同样计算新橙皮苷浓度 C10、C20、C30、C40、C50、C60。以稀释样新橙皮苷浓度除以纯样新橙皮苷浓度得到配制橙汁含量公式。

图2 标样新橙皮苷的光谱图Fig.2 Spectrogram of standard new hesperidin

式中：Xi 表示橙汁含量，%；Pi表示稀释样新橙皮苷含量，mg/L；P纯表示纯样新橙皮苷含量，mg/L；Si表示稀释样新橙皮苷HPLC 峰面积；S纯表示纯样新橙皮苷HPLC 峰面积。

当测定中使用同一新橙皮苷标准曲线时可以简化算式用新橙皮苷HPLC 峰面积直接计算。

2 结果与分析

2.1 新橙皮苷紫外最大吸收波长

标样新橙皮苷的光谱图见图2，标样新橙皮苷190 nm～400 nm 紫外吸收波长图见图3，标样新橙皮苷260、272、280 nm 和 290 nm 的 HPLC 色谱图见图4。

图3 标样新橙皮苷190 nm～400 nm 紫外吸收波长图Fig.3 UV absorption wavelength of standard hesperidin 190 nm-400 nm

图4 标样新橙皮苷HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of standard new hesperidin

测定新橙皮苷紫外最大吸收波长的方法是使用二级管阵列检测器同时检测成分的色谱和紫外光谱。测定标样新橙皮苷，光谱显示出紫外最大吸收波长280 nm；截取190 nm～400 nm 波长的紫外吸收光谱图，同样选择 260、272、280 nm 和 290 nm 的 HPLC 色谱图，列出 260、272、280 nm 和 290 nm 波长检测出 HPLC色谱图对应的强度值如图4 和表2。两种方法显示新橙皮苷紫外最大吸收波长为280 nm。

表2 不同波长检测出色谱图对应的强度值Table 2 Different wavelengths to detect the corresponding intensity values of excellent spectra

2.2 高效液相色谱仪的仪器精密度

高效液相色谱仪的仪器精密度即整机性能用定性和定量的重复性确定。为使分析结果准确，确保分析数据的可靠性，对高效液相色谱仪进行测量重复性验证，计算相对标准偏差。JJG705-2014《液相色谱仪检定规程》计量标准，规定了定性重复性测量结果的RSD≤1.0%；定量测量重复性测量结果的RSD≤3.0%。保留时间和峰面积重复性测定结果符合标准，满足本试验方法的要求见表3。

表3 保留时间和峰面积重复性结果Table 3 Retention time and peak area reproducibility results

2.3 新橙皮苷定性

将纯橙汁和乙腈1 ∶1（体积比）混合，经过离心、超声脱气和过滤后，转移到自动进样器样品瓶中，用相同条件处理新橙皮苷储备液并转移到自动进样器样品瓶中进行HPLC 色谱分析。纯橙汁中新橙皮苷定性采用保留时间和样品中加入新橙皮苷基准物，峰增高的方法完成定性见图5、图6 和图7。

图5 标样新橙皮苷的HPLC 色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of standard new hesperidin

图6 样品橙汁的HPLC 色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of sample orange juice

图7 样品橙汁加入标样新橙皮苷的HPLC 色谱图Fig.7 HPLC chromatogram of sample orange juice added with standard new hesperidin

保留时间18.6 min 的色谱峰是新橙皮苷，纯橙汁加入新橙皮苷内标物该峰明显增高，由此定性该峰为样品中新橙皮苷色谱峰。

2.4 新橙皮苷标准曲线的绘制

用1.3.1 配制的500 mg/L 的新橙皮苷储备液，采用逐级稀释法分别稀释配制5、10、15、20 mg/L 的标准液，线性回归法做新橙皮苷标准曲线见图8。

图8 新橙皮苷标准曲线Fig.8 Standard curve of new hesperidin

由图8 可知，在浓度5 mg/L～20 mg/L 范围内，以橙皮苷浓度及峰面积绘制标准曲线，y=4 857.5x-7 601.5，回归系数为0.997 1。

2.5 配制不同浓度样品的回收率试验

将配制不同浓度的橙汁样品分别处理出6 个样品，分别测定并获取新橙皮苷HPLC 峰面积，计算空白加标回收率，标准偏差和相对标准偏差。不同浓度的橙汁样品测定回收率试验结果见表4。

表4 不同浓度的橙汁样品测定回收率试验结果Table 4 Test results of recovery rate of orange juice with different concentrations

续表4 不同浓度的橙汁样品测定回收率试验结果Continue table 4 Test results of recovery rate of orange juice with different concentrations

由表4 可知，测定橙汁样品结果的回收率为98.52%～102.04%，相对标准偏差（RSD）为0.69%～3.08%，该方法的分析结果精密度较好，用该方法测定橙汁含量由较高可靠性。

2.6 国标方法与本方法检测橙汁含量结果

根据国标GB/T 16771-1997《橙、柑、橘汁及其饮料中果汁含量的测定》，对配制的不同浓度的橙汁样品，检测了可溶性固形物、钾、总磷、氨基酸态氮、L-脯氨酸、总D-异柠檬酸和总黄酮7 个指标的实测值计算橙汁含量的测试结果。同时对以上橙汁样品进行本方法测定并获取新橙皮苷HPLC 峰面积计算出橙汁含量，每个样品重复测定5 次取平均值，同配制含量进行比较，并计算相对误差见表5。两种测试方法结果相对误差在0.67%～3.66%之间，准确度较高。