响应面法优化枯草芽孢杆菌MX-6产纳豆激酶发酵条件

满丽莉，向殿军

（1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028042；2.内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽028042）

2008年世界卫生组织的报告显示，每年有1730万人死于心血管疾病，占全球年死亡总数的30%。血栓形成是导致心血管疾病的主要原因，其发病率和死亡率呈现逐年上升趋势，目前临床使用的纤溶酶（如尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原激活剂）具有成本过高和不良副作用等限制，因此开发有效性和特异性高的纤溶药物亟待解决[1-3]。纳豆激酶是一种具有广阔发展前景的丝氨酸蛋白酶，主要原因在于：①纤溶活性强，活性是纤溶酶的4 倍；②具有激活纤溶酶原活性和直接降解纤维蛋白的双重功能；③成本低、安全性高；④来源广泛。因此，纳豆激酶的研究备受国内外研究人员的关注[4-6]。

发酵条件优化对生物工艺开发、性能改善和工业化应用发挥至关重要的作用。发酵条件可通过传统或统计方法来优化，传统方法通常一次改变一个自变量，而将其他变量固定在一个水平上，此方法较为耗时，往往不易获得最优条件，应用统计方法可消除传统方法的局限性，能降低试验次数，节省时间和资源，同时有利于分析变量之间的交互作用[7]。近年来，响应面法（response surface methodology，RSM）在生物过程优化方面得到了广泛地应用，RSM 是一种有效用于设计试验、建立模型、评估因素影响、交互作用及获得最佳条件的统计方法[8]。纳豆激酶的微生物发酵过程较为复杂，理解、控制和优化发酵过程是一个关键步骤，通过响应面法建模为发酵过程的分析、设计和操作提供有用的信息，建立发酵动力学数学模型成为发酵行为的首要目标。本研究首先通过单因素试验，检测温度、初始pH 值、接种量、装液量及摇床转速对枯草芽孢杆菌MX-6 纳豆激酶合成量的影响，再以溶圈直径为响应值，应用响应面法中的Box-Benhnken 设计建模，确定最佳产酶条件，旨在为更合理地应用和开发纳豆激酶提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌MX-6（Bacillus subtilis MX-6）由豆豉中筛选鉴定获得。

1.1.2 试剂及培养基

凝血酶（1 000 U）：中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原、琼脂糖：美国Sigma 公司；其它药品均为国产分析纯。

基础种子培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

基础发酵培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

1.1.3 主要仪器设备

SW-CT 型超净工作台：郑州南北仪器设备有限公司；MJ-54A/MJ-78A 型STIK 灭菌锅：北京天赐科仪商贸有限公司；BPH-9082 型电热恒温培养箱：济南来宝医疗器械有限公司；Microfuge16 型离心机：美国贝克曼公司；WS-600 型恒温振荡培养箱：德国Wiggens 公司；DHP-600 恒温培养箱：常州中捷试验仪器制造有限公司；110-801 型三量ip67 防水原点数显卡尺不锈钢零点电子游标尺：东莞市景有模具五金有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法及优化前发酵条件

培养方法：挑取枯草芽孢杆菌MX-6 接种于装有50 mL 基础种子培养基的250 mL 锥形瓶中，37 ℃，160 r/min 条件下振荡培养 12 h（OD600=1.5～1.6）。

优化前发酵条件：将培养的菌液按5%接种于装有50 mL 基础发酵培养基的250 mL 锥形瓶中，30 ℃，初始pH 7.2，160 r/min 条件下振荡培养72 h。

1.2.2 纳豆激酶活力的测定

发酵液以 5 000 r/min 离心 10 min，取 10 μL 上清液用于纳豆激酶活性的测定。纳豆激酶活力的测定采用纤维蛋白平板法[9]，溶圈直径采用电子游标尺测定。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 温度对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响

将培养的菌液按5%接种于装有50 mL 基础发酵培养基的250 mL 锥形瓶中，发酵温度分别为22、27、32、37、42 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 条件下振荡培养72 h，获得粗酶液，按照1.2.2 的方法测定纳豆激酶活性。

1.2.3.2 初始pH 值对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响

将培养的菌液按5%接种于装有50 mL 基础发酵培养基的250 mL 锥形瓶中，30 ℃，初始pH 值分别为4、5、6、7、8，160 r/min 条件下振荡培养 72 h，获得粗酶液，按照1.2.2 的方法测定纳豆激酶活性。

1.2.3.3 接种量对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响

将培养的菌液分别按1%、2%、3%、4%、5 %接种于装有50 mL 基础发酵培养基的250 mL 锥形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 条件下振荡培养 72 h，获得粗酶液，按照1.2.2 的方法测定纳豆激酶活性。

1.2.3.4 装液量对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响

将培养的菌液按5%接种于分别装有25、50、75、100、125 mL 基础发酵培养基的250 mL 锥形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 条件下振荡培养 72 h，获得粗酶液，按照1.2.2 的方法测定纳豆激酶活性。

1.2.3.5 摇床转速对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响

将培养的菌液按5%接种于装有50 mL 基础发酵培养基的 250 mL 锥形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，分别在 160、170、180、190、200 r/min 条件下振荡培养 72 h，获得粗酶液，按照1.2.2 的方法测定纳豆激酶活性。

1.2.4 响应面法优化纳豆激酶发酵条件

应用Design-Expert 软件中的Box-Benhnken 设计构建模型，响应面法寻找最佳发酵条件。以温度（A）、初始 pH 值（B）、接种量（C）、装液量（D）、摇床转数（E）5 个因素为自变量，溶圈直径（mm）为响应值，运用五因素三水平的响应面分析试验，共46 个试验点，其中40 个为析因子，6 个为中心试验。试验因素水平见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.2.5 数据分析

应用SPSS 17.0 软件中的One-way analysis of variance 计算标准差。采用Design-Expert 8.0.6 软件中Box-Benhnken 设计进行响应面数据分析。

2 结果与分析

2.1 温度对纳豆激酶活力的影响

温度对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响见图1。

图1 温度对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响Fig.1 Effect of temperature on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

温度为37 ℃时，纳豆激酶活性最大，溶圈直径可达（18.23±0.17）mm。温度为22 ℃或42 ℃产酶活性均较低，22 ℃菌体生长较缓慢，42 ℃菌体生长迅速，但提早进入衰亡期，近而影响纳豆激酶的合成量。

2.2 初始pH值对纳豆激酶活力的影响

初始pH 值对枯草芽孢杆菌MX-产纳豆激酶的影响见图2。

图2 初始pH 对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响Fig.2 Effect of initial pH on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

初始pH 值为7.0 时，纳豆激酶的活性最大，溶圈直径可达（18.19±0.32）mm，表明枯草芽孢杆菌MX-6适宜产酶条件为近中性。当初始pH 值为4 或8 时产酶活性均较低，说明酸性或碱性条件不利于纳豆激酶的合成，可能是培养基中的H+或OH-会改变菌体内纳豆激酶的活力和结构所导致的。

2.3 接种量对纳豆激酶活力的影响

接种量对枯草芽孢杆菌MX-产纳豆激酶的影响见图3。

图3 接种量对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

由图3 可知，接种量为3%时，纳豆激酶的活性最大，溶圈直径可达（17.57±0.14）mm。接种量过大（5%）会使营养物质快速消耗，接种量过小（1%）会影响菌体内某些辅酶和维生素的扩散，均不利于酶的合成。

2.4 装液量对纳豆激酶活力的影响

装液量对枯草芽孢杆菌MX-产纳豆激酶的影响见图4。

由图4 可知，装液量为50 mL 时，纳豆激酶的活性最大。枯草芽孢杆菌MX-6 为需氧菌，装液量过大（125 mL）会使溶氧量过低，装液量过小（25 mL），由于发酵中水分蒸发易导致菌体提早衰亡，不利于纳豆激酶的工业化生产。

图4 装液量对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响Fig.4 Effect of liquid medium volume on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

2.5 摇床转速对纳豆激酶活力的影响

摇床转速对枯草芽孢杆菌MX-产纳豆激酶的影响见图5。

图5 摇床转数对枯草芽孢杆菌MX-6 产纳豆激酶的影响Fig.5 Effect of shaker speed on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

由图5 可知，摇床转速为170 r/min 时，纳豆激酶的活性最大，溶圈直径可达（16.37±0.18）mm。适宜的摇床转速能提高溶氧量，有利于枯草芽孢杆菌MX-6的生长及纳豆激酶合成。

2.6 响应面法优化纳豆激酶的发酵条件

2.6.1 模型建立及显著性分析

以溶圈直径为响应值，运用Box-Benhnken 设计46 组试验。Box-Benhnken 试验设计及结果见表2。

表2 Box-Benhnken 试验设计及结果Table 2 Experiment design and results of BBD

续表2 Box-Benhnken 试验设计及结果Continue table 2 Experiment design and results of BBD

二次回归模型为：Y=-450.691 52+4.272 02A+16.533 75B+5.890 37C+0.116 07D+3.808 16E+7.500 00×103AB-5.000 00×104AC+ 1.000 00×104AD-5.000 00×105AE+1.293 41×1014BC+2.000 00×104BD-2.500 00×104BE-2.700 00×103CD+2.500 00×104CE+1.200 00×104DE-0.058 858A2-1.208 13B2-0.953 96C2-1.367 67×103D2-0.011 206E2。

对二次回归模型的方差分析结果见表3。

表3 二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the quadratic model

该模型的P＜0.01，表明试验所采取的二次模型极显著。失拟项的P=0.087 8＞0.05，模型失拟项不显著，决定系数=0.999 5，表明模型与实际情况拟合较好，可应用该模型对试验结果预测和分析。模型中A、B、C、D、AB、CD、A2、B2、C2、D2、E2的 P＜0.01，表明对纳豆激酶合成量的影响极显著。DE 的P＜0.05，表明对纳豆激酶合成量的影响显著。交互项 AC、AD、AE、BC、BD、BE、CE 的P＞0.05，说明这些交互作用对纳豆激酶合成量无显著性影响。

2.6.2 响应面分析

优化条件下的3D 响应面图见图6。

图6 优化发酵条件下的3D 响应面图Fig.6 3D response surface curve under optimal fermentation conditions

各因素的变化范围分别为温度（32 ℃～42 ℃），初始pH 值（6～8），接种量（2%～4%），装液量（25 mL～75 mL），摇床转速（160 r/min～180 r/min）。在分析两因素之间的交互作用时，其中一个因素固定，随着另一个因素的增加，纳豆激酶的合成量均呈现先增加后减少的趋势。优化发酵条件为温度36.69 ℃、初始pH 6.94、接种量3.03%、装液量48.77 mL、摇床转速170.05 r/min。预测的溶圈直径为20.62 mm。

2.6.3 回归模型的验证试验

为检验预测结果的可靠性，采用优化发酵条件（温度36.69 ℃、初始pH 6.94、接种量3.03 %、装液量48.77 mL、摇床转速170.05 r/min）进行验证试验。实际溶圈直径为（20.71±0.18）mm，与预测的溶圈直径20.62 mm 相比较差异不显著（P＞0.05），表明该模型可靠性好。与优化前的溶圈直径（15.28±0.13）mm 相比，溶圈直径提高了35.54%，可见该模型能较好地预测纳豆激酶的合成情况。

3 结论

纳豆激酶具有成本低、活性高、安全无毒等优点，已成为当今研究的热点[10-11]。增加纳豆激酶合成量的主要方法包括：筛选纳豆激酶高产菌株；优化发酵条件或培养基；诱变育种。由于枯草芽孢杆菌在非适宜条件下极易形成休眠体-芽孢，导致纳豆激酶的合成终止，优化发酵条件是显著提高纳豆激酶合成量的有效方法之一[3，12]。本研究应用响应面法综合分析发酵条件对枯草芽孢杆菌MX-6 合成纳豆激酶的影响，优化的最佳发酵条件为：温度36.69 ℃、初始pH 6.94、接种量3.03%、装液量48.77 mL、摇床转速170.05 r/min。优化发酵条件下溶圈直径可高达20.71 mm，与响应面预测值相比差异不显著，表明构建模型的可行性和可靠性，通过响应面法优化纳豆激酶最佳发酵条件具有科学性和准确性，有利于纳豆激酶作为新型溶栓药物和功能性食品添加剂的应用奠定基础。