传统东北酸菜中乳杆菌的分离鉴定及其降胆固醇特性研究

马长路，焦梦丽，罗红霞，逄晓阳，芦晶，张书文，吕加平，*，妥彦峰

（1.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京102442；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；3.北京农学院食品科学与工程学院，北京102206；4.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

半个世纪以来，心脑血管疾病已成为威胁人类健康的首要疾病，其死亡率已超过所有癌症的总和。流行病学和临床调查表明，高胆固醇是引发该疾病的重要因素之一，降低血清胆固醇水平，特别是低密度脂蛋白水平，能显著降低该疾病的发病率和死亡率[1-3]。某些乳酸菌菌株，能够促进胃肠道吸收，增加肠道有益菌群，改善人体胃肠道功能，抑制腐败菌的繁殖，提高机体免疫力等重要生理功能[4]。国内外有研究表明：部分乳酸菌具有较强的降胆固醇能力，长期食用含乳酸菌的食品或乳酸菌发酵食品可有效降低人体血液中的胆固醇质量分数，从而大大减少心血管疾病的发生[5]。酸菜作为我国东北地区的一种传统乳酸菌蔬菜发酵制品，其以营养丰富、酸鲜脆嫩、解腻开胃等特点深受广大群众的喜爱，且研究表明酸菜汁液中富含大量乳酸菌[6]。本试验选用MRS 培养基从东北农家自然发酵的酸菜中分离乳酸菌，通过体外试验研究其功能特性，筛选出具有耐酸耐胆盐、降胆固醇能力的菌株，并进行菌种鉴定，丰富降胆固醇乳酸菌菌种资源库，也为后续试验提供材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

酸菜汁液：采自黑龙江佳木斯市农家发酵酸菜，采集样品于离心管内，加入无菌甘油使终浓度为25%，于-80 ℃冰箱保存。

MRS 培养基：北京陆桥技术股份有限公司；MRSCHOL 培养基[7]：胆固醇 1.0 g，加 1 mL 吐温-80 助溶，加入1 000 mL MRS 液体培养基中，调pH 值至7.0。

革兰氏染色试剂盒、乳酸菌生化鉴定试剂盒：北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、引物、TE 缓冲液、DNA Marker、ddH2O、Mix 液：天根生化科技有限公司；牛胆盐、胆固醇（99 %）：美国sigma 公司；邻苯二甲醛、氯化钠、盐酸、冰乙酸、正己烷、无水乙醇、氢氧化钾等试剂均为分析纯级：国药化学试剂集团。

1.2 主要设备及仪器

DHP-9082 恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HDL 超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；GL124-1SCN 万分之一分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LDZX-50KB 立式压力蒸汽灭火器：上海申安医疗器械厂；PHS-3C 雷磁pH 计：上海精密科学仪器有限公司；SHB-III 循环水式多用真空泵：上海振捷实验设备有限公司；CX41RF 显微镜：日本奥林巴斯公司；TP600 梯度 PCR 仪：日本 TAKARA 公司；Sigma-3K15 离心机：德国SIGMA 科技有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计：岛津仪器有限公司；DYY-6C 电泳仪：北六一仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的初步分离纯化

将带回的酸菜汁液解冻，以备使用。采用梯度平板稀释法，吸取酸菜汁液于0.85%理盐水中进行梯度稀释，然后涂布于含0.5%CaCO3的固体MRS 培养基上，37 ℃静置培养48 h，挑选平板上有明显透明圈的菌落，在MRS 平板上多次划线纯化直至菌落形态单一，挑取单菌落到MRS 液体培养基增菌培养24 h，记录菌落特征，于4 ℃冰箱存储备用[8-10]。

1.3.2 生理生化鉴定试验

对菌株进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验、采用乳酸菌生化鉴定试剂盒做碳水化合物（蔗糖、甘露醇、山梨醇、水杨苷等）发酵试验[5]。

1.3.3 菌种16S rDNA 鉴定试验[5]

采用细菌基因组DNA 试剂盒提取细菌DNA，利用引 物 27F （5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 进行扩增；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应程序为：95 ℃预变性 4 min；95 ℃变性 45 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，循环 30 次；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 产物经1%琼脂糖电泳分析后，送交华大基因公司进行16S rDNA 测序，所得序列在NCBI 中进行比对，确定菌种。

1.3.4 降胆固醇乳酸菌的筛选

绘制胆固醇标准曲线：取1 mL 的配制质量浓度为0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 的胆固醇系列标准溶液，加入3 mL 95%乙醇、2 mL 50%氢氧化钾，旋涡振荡混匀。于60 ℃下恒温水浴10 min，冷却后加入5 mL 正己烷，旋涡振荡萃取1 min～2 min，加入2 mL蒸馏水，振荡均匀，静置分层。吸取2 mL 上层正己烷，60 ℃水浴氮气吹干，加入4 mL 0.5 mg/mL 邻苯二甲醛溶液和2 mL 浓硫酸，显色反应20 min，测定吸光值（A550）并绘制胆固醇标准曲线[11]；

乳酸菌降解胆固醇能力测定：将培养好的乳酸菌菌液，按5%接种量接种于10 mL 降胆固醇筛选培养基（MRS-CHOL 培养基）中，取1mL 上清液测胆固醇含量作为空白；再于37 ℃静置培养48 h，摇匀后立即取样1 mL，12 000×g 离心5 min，用邻苯二甲醛比色法测定上清中胆固醇含量[12]。平行试验3 次取平均值。

式中：A 为受试菌株在MRS-CHOL 培养基中37 ℃静置培养 48 h 后胆固醇残留量，mg/mL；C 为空白MRS-CHOL 培养基中胆固醇含量，mg/mL。

1.3.5 耐酸耐胆盐试验[2，13-15]

将接种于MRS 液体培养基的乳酸菌按2%接种量接种于 pH=3.0、pH=4.0、pH=5.0 液体 MRS 培养基中，37 ℃培养 24 h，以 pH=6.0 的 MRS 培养基为空白对照，测各组菌液的OD600nm值，重复3 次取平均值。

式中：N 为菌株在不同pH 值培养液中培养24 h后的OD 值；N0为菌株在pH=6.0 培养液中培养24 h后的OD 值。

配制胆盐浓度为1、2、3 g/L 的液体MRS 培养基，将乳杆菌液按2%接种量接种于不同胆盐浓度MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，以不加胆盐的MRS 培养基为空白对照，测各组菌液的OD600nm值；

式中：A 为测试菌株在不同胆盐浓度培养液中培养24 h 后菌液的OD 值；A0为菌株在不含胆盐培养液中培养24 h 后菌液的OD 值。

1.3.6 统计分析

采用Excel、SPSS19.0 软件分析处理数据。

2 结果分析

2.1 酸菜中乳酸菌分离及鉴定结果

对100 个酸菜样本中乳酸菌进行分离培养，最终成功分离鉴定10 株菌，并对此10 株菌定义编号为M：姓氏马+H：黑龙江缩写黑+S：酸菜+年限+编号；即 MHS1701、MHS1702、MHS1703、MHS1704、MHS1705、MHS1706、MHS1707、MHS1708、MHS1709、MHS1710。经培养，10 株菌菌落呈中等大小，有凸起，乳白色，湿润，明显溶钙圈，边缘整齐，菌落呈圆形，且挑取时具有黏性。

10 株菌革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶反应呈阴性，并对其碳水化合物利用特性进行测定，结果如表1所示。

表1 乳酸菌分离菌株菌落特征Table 1 Colony characteristics of lactic acid bacteria isolates

MHS1704 不发酵山梨醇，MHS1710 不水解蔗糖。根据查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》，乳杆菌属细菌可利用的碳源有葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、糊精、七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖等，结合试验结果分析，初步判断10 株菌均为乳酸杆菌属。

采用细菌DNA 基因组试剂盒提取10 株菌株基因组DNA，产物通过PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，最终检测电泳图有且只有一个条带，标准Marker条带为2 000 bp，各菌株条带在1 000 bp 左右。菌株DNA 提取产物条带单一，且与预期目的大小一致，可以满足后续测序要求。

利用 BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），将所测定的10 株菌株的16S rDNA 序列，与GenBank/EMBL/DDBJ 数据库对比[7]，具体鉴定结果如表2 所示。

表2 16S rDNA 序列对比结果Table 2 Comparison of 16s rDNA sequences

酸菜中微生物多样性大多采用传统培养的方法进行筛选分离、鉴定。目前，李欣等[4]采自大庆地区的传统酸菜发酵液中分离得到14 株菌株，其中4 株弯曲乳杆菌、3 株清酒乳杆菌、5 株植物乳杆菌、1 株短乳杆菌和1 株肠膜明串珠菌。栗永乐等[6]从内蒙古东部地区采集的14 份农家酸菜汁中分离出84 株乳酸菌，分别鉴定为植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌和耐酸乳杆菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、植物乳球菌、肠膜明串株菌。奎梦漪等[16]从云南自然发酵酸菜液中的优势乳酸菌分离出12 株乳酸菌，分别为植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌。本研究从传统东北农家酸菜中分离得到10 株菌，经16S r DNA 序列分析鉴定为植物乳杆菌、棒状乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌。传统发酵酸菜是一个丰富的乳酸菌资源库，并且酸菜具有悠久的安全食用史，因此可以从中筛选具有潜在益生功能的乳酸菌菌株。

2.2 乳酸菌降胆固醇结果

采用邻苯二甲醛法获得胆固醇标准曲及回归方程为y=2.487 5x-0.024 7，R2=0.997 8，呈现良好的线性关系。

通过邻苯二甲醛法测定10 株乳杆菌的胆固醇去除情况，结果如表3 所示。

10 株乳杆菌都具有一定的降解胆固醇的能力，胆固醇脱除率从9%～60%不等，不同菌株间胆固醇脱除率差异较大，与黄燕燕等[2]研究结果类似。其中菌株MHS1701、MHS1703、MHS1706 的胆固醇脱除率超过40%以上，分别为40.71%、52.84%、41.41%，菌株MHS1701、MHS1706 较汪晓辉等[12]的研究结果偏低，可能与酸菜样本、乳酸菌个体差异、培养条件等因素有关。初筛结果选取 MHS1701、MHS1703、MHS1706 3 株脱除率高的菌株。

表3 乳酸菌去除胆固醇试验结果（n=3）Table 3 Results of cholesterol removal test by lactic acid bacteria（n=3）

2.3 乳酸菌在低pH值及高胆盐条件下的存活性

10 株不同乳杆菌在不同pH 值培养液及含不同胆盐培养液中的生长状况如表4、表5 所示。

表4 MHS1701～MHS1710 的耐酸性（n=3）Table 4 Acid tolerance of MHS1701-MHS1710（n=3） %

为保证乳酸菌在胃肠道内具有良好的存活能力，必须有耐胃酸耐胆盐的特性。结合表4、表5 耐酸耐胆盐结果可知，10 株乳酸菌MHS1701～MHS1710 在不同pH 值和不同胆盐浓度下的耐受能力相差不大。10 株乳酸菌耐酸性随着pH 值降低而降低，在pH=3 下各菌株的耐酸能力较小；随着胆盐浓度上升，各菌株的耐胆盐能力有小幅度下降，此结果与林龙镇等[15]经不同培养条件下平板计活菌数的结果一致。其中筛选得到的降胆固醇能力较好的3 株目标菌株MHS1701、MHS1703、MHS1706 中 MHS1701 在 pH=3 下的耐酸性最强，为2.03 %；目标菌株中MHS1701 耐胆盐效果最好，达11.95 %。因此，菌株MHS1701 具有优良功能特性。

表5 MHS1701～MHS1710 的胆盐耐受性（n=3）Table 5 Gallbladder salt tolerance of MHS1701-MHS1710（n=3）%

3 结论

本试验从传统东北发酵酸菜中分离获得植物乳杆菌、棒状乳杆菌、干酪乳杆菌及短乳杆菌共10 株菌；要求筛选出的乳酸菌除了具备特定的降胆固醇功能以外，还必须具有益生菌所共有的优良特性，试验表明各菌株在pH 值为3.0 的环境以及3 g/L 的胆盐浓度下具有一定的耐受性；各菌株胆固醇脱除率在9%～60%之间，MHS1701、MHS1703、MHS1706 菌株的胆固醇清除能力分别达41%、53%、41%，且MHS1701 的耐酸耐胆盐能力最强。因此传统东北酸菜可以作为降解胆固醇乳酸菌的来源库，通过体外培养筛选得到的植物乳杆菌MHS1701 的功能特性最明显，有实际应用价值。