肺炎支原体检测试剂盒快速培养法与LAMP法用于肺炎支原体检测研究

高静 阎建侠 刘博雅 李正 罗天侠 纪颖

1 天津市武清区人民医院检验科 （天津 301700）

2 天津市武清区人民医院儿科 （天津 301700）

内容提要： 目的：分析肺炎支原体检测试剂盒快速培养法与LAMP法用于肺炎支原体检测的价值。方法：选取本院儿科2017年1月～2018年6月收治的疑似肺炎支原体肺炎患儿100例作为研究对象，分别给予肺炎支原体检测试剂盒快速培养法与LAMP法检测肺炎支原体，同时与实时荧光定量PCR法做比对，分析两种检测方法的实验反应时间与阳性率。结果：LAMP法检测肺炎支原体的实验反应时间短于肺炎支原体检测试剂盒快速培养法，阳性率高于快速培养法，P＜0.05。结论：LAMP法用于肺炎支原体检测的实验反应时间较短、阳性率较高，有很好的应用前景。未来应加深对LAMP法检测肺炎支原体的研究，克服检测中的困难，扩大LAMP法检测肺炎支原体的应用范围。

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是人肺炎支原体肺炎的病原体。有研究表明，肺炎支原体有一定的传染性，是引起儿童呼吸道感染的常见病原体之一。临床表现具有多样性，多为剧烈咳嗽、发热、畏寒、头痛、咽痛，以上呼吸道感染、支气管肺炎最为常见，一些患者由上呼吸道感染可发展至重症肺炎[1]。肺炎支原体感染是支原体肺炎的重要表现因素，是急性呼吸道感染的常见病原体。近年来，肺炎支原体感染的发病率呈增高趋势，因其临床表现无特异性，易与细菌性和病毒性感冒混淆，故早期的实验室检测对临床诊治具有重要意义[2]。本研究纳入2017年1月～2018年6月本院儿科收治的疑似肺炎支原体患儿100例作为研究对象，同时给予肺炎支原体检测试剂盒快速培养法、LAMP法进行检测，并与实时荧光PCR法比对，现将具体资料及研究结果报告如下。

1.资料和与方法

1.1 临床资料

病历来源为本院儿科2017年1月～2018年6月收治的疑似肺炎支原体肺炎患儿100例，其中男童62例，女童38例，年龄4个月～11岁，平均（5.04±1.44）岁。所有患儿家长对本研究知情同意。

1.2 纳入与排除标准

（1）纳入标准：具有发热（体温≥38°C），伴咳嗽或咽痛等呼吸道感染症状，病程在7d以内，以社区获得性肺炎或肺炎支原体肺炎为主。

（2）排除标准：患有肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸性粒细胞浸润症及免疫功能低下等患儿。

1.3 材料

1.3.1 样品与试剂

MP阳性质粒、100例临床标本；

DNA提取试剂盒（德国凯杰生物公司）；

FLUO-LAMP反应液（Master Mix，弗罗朗生物科技有限公司）；

MP引物（英潍捷基（上海）贸易有限公司合成）；

肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（荧光PCR法，上海复兴长征医学科学有限公司）；

肺炎支原体快速培养法试剂盒（武汉菁华时间科技有限公司）。

1.3.2 仪器

恒温扩增荧光PCR仪（FLUO-GENE，弗罗朗生物科技有限公司）；

小型离心机（弗罗朗生物科技有限公司）；

实时荧光PCR仪（LC480，罗氏）。

1.4 方法

1.4.1 快速培养法。棉拭子吸附生理水在患儿喉深部捻转数次，肺炎支原体对细菌表面有很强的亲和力，应尽可能收集到更多样本。采用肺炎支原体的检测试剂盒，按说明书将呼吸道咽拭子放置于培养基瓶内搅动，靠瓶壁挤尽残液，旋紧瓶盖后放置于37°C温箱培养，6～12h内观察结果，试剂颜色由红色变为清亮黄色则为阳性，试剂颜色为红色、淡红色则为阴性[3]。

1.4.2 LAMP法。利用MP阳性质粒核酸，按10倍梯度稀释，重复实验，选择可检出的最低浓度；将引物浓度由原工作浓度逐渐增加，利用低浓度阳性核酸重复实验，选择最佳引物浓度，优化反应效率。使用专用一次性咽拭子采集管进行标本收集，DNA提取采用专用MP-DNA提取试剂盒。LAMP检测样本，按以下条件进行恒温扩增反应：

反应体系（25μL）：F3 1μL，B3 1μL，FIP 1μL，BIP 1μL，LF1μL，LB 1μL，Master Mix 15μL，模板4μL。

反应温度：63～65°C，退火温度（Anneal）：98～80°C。每次反应除检测样本外，同时设置质控系统，进行阳性对照和阴性对照。通过对比阳性对照与阴性对照、观察溶解曲线的峰值来确定反应的准确性。

1.4.3 实时荧光定量PCR法检测样本

参照MP核酸检测试剂盒说明书进行反应，同时进行阳性对照和阴性对照。

1.5 统计学分析

采用统计学软件SPSS 20.0进行数据分析处理，计量资料以±s表示，进行t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

表1. 两种方法检测结果与实时荧光定量PCR法对比(例)

表2. 快速培养法与LAMP法检测结果(例)

肺炎支原体检测试剂盒快速培养法的实验反应时间为6～12h，平均（7.41±0.91）h；LAMP法的实验反应时间为0.25～1h，平均（0.70±0.11）h；t=9.972，P＜0.05。

使用两种方法分别检测100例标本，同时与实时荧光定量PCR法比对，检测结果如表1所示。

由于方法学差异等原因，两种检测结果存在不一致。肺炎支原体检测试剂盒快速培养法与LAMP法检测结果差异如表2所示。

快速培养法检测肺炎支原体的阳性例数为18例，阳性率为18%；LAMP法检测肺炎支原体的阳性例数为34例，阳性率为34%；χ2=8.775，P＜0.05。

我们将实时荧光定量PCR法作为标准进行比对：LAMP法与实时荧光定量PCR法进行检测，只有一个结果出现偏差；快速培养法检测的阳性例数较低，且阳性的18例标本中只有10例与LAMP法和实时荧光PCR法结果一致，这其中真菌和耐药菌是快速培养法假阳性最主要的因素。此外，标本的采集、口腔中食物残渣及酸性饮料也会影响快速培养法的结果判定。肺炎支原体检测试剂盒快速培养法检测阴性，而LAMP法和实时荧光PCR法阳性，主要是由于PCR的检出率相对较高，猜测可能与标本的采集、肺炎支原体的携带等有关。

3.讨论

肺炎支原体常存在于纤毛上皮细胞之间，不侵入肺实质，可通过细胞膜上神经氨酸受体点位吸附于机体呼吸道上皮细胞表面，抑制纤毛活动、破坏上皮细胞，继而引发支气管炎、肺炎等疾病[4]。肺炎支原体感染发病初期症状并无显著特异性，更多表现为急性呼吸道感染、气管支气管炎等，有时合并其他并发症，发病初期易因用药不当而延误治疗。肺炎支原体常见的实验室诊断方法有培养法、PCR检测、肺炎支原体快速培养、血清抗体检测法等。基于肺炎支原体检测试剂盒的肺炎支原体病原体培养检测是目前肺炎支原体检验的金标准，其原理为在培养基中添加适合肺炎支原体自身的生长因子刺激肺炎支原体大量增殖，对培养基中特异性代谢产物进行检测，进一步鉴别肺炎支原体。但这种方法实验条件苛刻、生长缓慢、耗时较长[5]。近年来，肺炎支原体快速培养法不断发展并在临床中获得广泛应用，其原理在于利用培养基中快速生长因子进行增殖分解糖类产生氢离子使培养基中pH值下降，然后观察培养基中酚红指示剂即可判断肺炎支原体生长情况。当患者感染肺炎支原体后会刺激机体B细胞产生相应IgM和IgG抗体，通过血清学检测方法检测肺炎支原体一般有冷凝集试验、酶联免疫吸附反应、补体结合试验、间接免疫荧光法、被动颗粒凝集法、金标法等几种方式，但在肺炎支原体感染初期一般仅发生局部免疫，不伴随体液免疫反应，故该方法不能在肺炎支原体感染初期起到检测目的，在感染急性期作用较好[6]。基于荧光PCR仪的PCR检测即聚合酶链反应，是一种分子基因检测方法，现在已广泛用于肺炎支原体的检测。常规PCR检测选取患者的咽拭子、痰液、肺部灌洗液等作为样本，并在琼脂糖凝胶电泳中直观分析结果。实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上进行优化的一种方法，该方法与常规PCR方法相比较检测特异性较好，自动化程度较高，可对微量病原体进行检测。但PCR检测设备昂贵，技术要求较高。

LAMP法，英文名为Loop-mediated isothermal ampli fication，即环介导恒温PCR。作为一种新的基因诊断技术，LAMP法针对目标基因DNA或cDNA在6个不同区域设计4条引物，利用恒温聚合酶（BstDNA聚合酶），在60～65°C恒温下完成扩增。利用LAMP法1h内即可完成扩增109～1010个数量级。LAMP法检测肺炎支原体的原理在于以核酸分子体外扩增技术为基础，该方法与PCR技术相似，但不依赖昂贵的仪器设备，因此非常适合基层实验室病原微生物的检测。与PCR技术相比较，LAMP法多2条引物。引物设计方面，LAMP法需保证在不同的6个区域结合目的DNA进行扩增反应。实验反应时间通常为15～60min，一般30min内即可完成，判断结果时直接通过扩增曲线和溶解曲线即可判断。本组研究中快速培养法的平均实验反应时间（7.41±0.91）h；LAMP法平均实验反应时间为（0.70±0.11）h，P＜0.05，表明LAMP法检测肺炎支原体在实验时间方面更具优势。本组研究中LAMP法检测肺炎支原体，以MP阳性质粒核酸为样本，在选择引物序列、提高引物浓度和反应温度等条件上进行优化，使反应效率最佳。为了使检测结果真实可靠，每次实验均设置质量控制、阳性对照、阴性对照以监测反应流程，避免出现假阴性和假阳性结果。结果显示，LAMP法检测肺炎支原体阳性率高于快速培养法。目前LAMP法广泛用于人、动物、植物的病原体检测，如禽流感、艾滋病、SARS等，且很多公司已合成出专业的试剂盒，可在短时间内检测出相关病原体。现阶段在国外已有很多研究者利用LAMP法检测肺炎支原体。尽管LAMP法检测肺炎支原体发展时间较短，但技术特点鲜明，特异性高，总耗时长短。

本课题所建立的方法在保证特异性强、灵敏度高的基础上，操作更简便，对环境要求相对较低。在经过优化反应并检测样本核酸后，发现样本中核酸浓度高时（＞=300cps/μL）本方法检测时间只需20～30min，而样本核酸浓度较低（＜300cps/μL）本方法检测时间需要1h才可完成，这是近期亟待解决的问题之一。使用分子生物学检测技术，需要从样本中提取核酸，有效的提取才能保证之后的成功检验。因此，未来希望能实现核酸简单高效提取方法，甚至可以和扩增反应同时进行。相信随着临床研究的深入以及检测技术的进一步发展，一定能够更加准确、快速地诊断并有效治疗肺炎支原体感染。