miRNA-613在乳腺癌中的表达及作用机制

朱克鹏 肖勋蓉 罗义 弋文 尹均明 杨川 杜果城

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，同时也是女性癌症相关性死亡最主要的原因。微小RNA（microRNA，miRNA）-613 是近年来发现的miR⁃NA 家族重要成员之一，研究发现其在宫颈癌［1］、胃癌［2］、卵巢癌［3］及非小细胞肺癌［4］等多种恶性肿瘤中异常表达，可能与恶性肿瘤的发生进展相关，但在乳腺癌中miRNA-613 表达及作用机制尚不完全清楚。本研究旨在通过检测乳腺癌组织和细胞中miRNA-613的表达，进一步探讨miRNA-613对乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能的分子机制，为乳腺癌的靶向治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2017年5月至2018年5月91例于南充市中心医院手术切除的乳腺癌患者的组织标本，癌旁组织距肿瘤边缘5 cm 以上，组织离体后30 min 内存储于液氮中，转移至-80℃低温冰箱待检测。患者未行放化疗及其他抗肿瘤治疗，术后病理均经病理学检测确诊。本研究获得医院伦理委员会批准且得到受试者知情同意。

1.1.2 细胞与主要试剂 人高侵袭转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231 和MDA-MB-468、低侵袭转移性乳腺癌细胞系MCF-7 及人正常乳腺上皮细胞系HBL-100 均 购 自 美 国ATCC 公 司。TRIzol 及Lipo⁃fectamine 3000均购自美国Invitrogen公司，miRNA-613及U6 引物、miRNA-613 模拟物、模拟物阴性对照均购自上海吉玛制药公司；逆转录及实时荧光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）试剂盒购自大连宝生物公司；CCK-8 试剂盒购自江苏碧云天生物公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司；Matrigel基质胶购自美国BD 公司；野生型、突变型双荧光素酶报告质粒pMIR-SOX9-WT、pMIR-SOX9-Mut 均购自广州锐博生物公司；双荧光素酶报告基因活性检测试剂盒购自美国Promega 公司；SOX9、β-catenin、GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；E-Cadherin和Vimentin抗体购自美国CST公司；HRP标记的二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR检测 qRT-PCR扩增条件为95℃预变性10 min，95℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，共40个循环。miRNA-613引物序列上游为5'-GTGAGT GCGTTTCCAAGTGT-3'，下游为5'-TGAGTGGCAAAG AAGGAACAT-3'；U6 引物序列上游为5'-GCGCGT CGTGAAGCGTTC-3'，下游为5'-GTGCAGGGTCCGAGG T-3'。以U6作为内参，miRNA-613表达水平采用2-△△Ct法计算，△△Ct=［Ct（miRNA-613）-Ct（U6）］实验组-［Ct（miRNA-613）-Ct（U6）］对照组。

1.2.2 TCGA数据库分析 分析TCGA数据库中乳腺癌患者的miRNA-613 表达和相对应的生存资料，对miRNA-613 低表达组538 例和高表达组537 例进行生存分析。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板进行转染，转染后细胞分为miRNA-613模拟物组和阴性对照（NC）-模拟物组，转染24 h后收集细胞，检测转染效率行后续实验。

1.2.4 CCK-8实验 收集对数生长期细胞接种于96孔板中，转染后每24 h加入10 μL/孔CCK-8溶液，继续避光孵育2 h，酶标仪测定各孔450 nm波长处的吸光度值（A450nm）。

1.2.5 Transwell 侵袭及迁移实验 Transwell 小室置于24孔板内，小室内膜均匀涂抹Matrigel胶凝固成膜行侵袭实验，使用无血清培养基重悬细胞制作细胞悬液，加入上室，同时在下室加入500 μL含有10%胎牛血清的培养基，37℃孵箱继续培养24 h 后取出小室，棉签轻轻擦拭掉上室内膜黏附的细胞，甲醛固定、染色，显微镜下计数穿膜细胞数。Transwell 小室内膜上不涂抹Matrigel胶，同样操作行迁移实验。

1.2.6 miRNA-613 靶基因SOX9 的预测 通过miR⁃NA在线靶基因预测网站TargetScan和miRanda，预测miRNA-613作用靶基因SOX9。

1.2.7 双荧光素酶报告实验 取MDA-MB-231接种于96孔板，将双荧光素酶报告质粒和miRNA-613模拟物（或NC-模拟物）共转染至MDA-MB-231 细胞，分为miRNA-613模拟物+pMIR-SOX9-WT组、NC-模拟 物+pMIR-SOX9-WT 组、miRNA-613 模拟物+pMIR-SOX9-Mut 组、NC-模拟物+pMIR-SOX9-Mut组。转染48 h后裂解细胞，检测荧光素酶活性。

1.2.8 Western blot 检测 收集细胞样品，提取细胞总蛋白，每组取等量蛋白样品行SDS-PAGE 凝胶电泳，转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶里室温封闭2 h后，加入一抗SOX9、β-catenin、E-Cadherin、Vimentin 和GAPDH 抗体，次日室温孵育后再加入二抗。超敏ECL发光试剂进行显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料采用表示，数据比较采用t检验或单因素方差分析；计数资料采用n表示，比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织和细胞中miRNA-613的表达

乳腺癌组织中miRNA-613的表达显著低于癌旁组织（P＜0.05，图1A），乳腺癌细胞系MCF-7、MDAMB-231、MDA-MB-468中miRNA-613的表达显著低于正常乳腺上皮细胞系（P＜0.05），并且高侵袭转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468 中miR⁃NA-613 的表达显著低于低侵袭转移性乳腺癌细胞系MCF-7（P＜0.05，图1B）。

图1 乳腺癌组织和细胞中miRNA-613的表达

2.2 乳腺癌组织中miRNA-613 表达与患者临床病理特征的相关性

以乳腺癌组织中miRNA-613表达水平的均值作为界值，分为低表达miRNA-613 组47 例和高表达miRNA-613 组44 例，分析显示miRNA-613 表达与TNM 分期和淋巴结转移有显著性相关（P＜0.05），而与年龄、肿瘤最大直径、组织学分级、ER、PR、HER-2状态无显著相关（P＞0.05，表1）。TCGA 数据库分析显示，miRNA-613 表达与乳腺癌患者的总生存率无关（P＞0.05，图2）。

2.3 上调miRNA-613 表达对MDA-MB-231 细胞增殖活性的影响

miRNA-613模拟物组的miRNA-613表达明显高于NC-模拟物组（P＜0.05，图3A），miRNA-613模拟物组的A450nm值明显低于NC-模拟物组（P＜0.05，图3B）。

表1 miRNA-613表达与乳腺癌患者临床病理特征的相关性

图2 miRNA-613表达对乳腺癌患者总生存率的影响

2.4 上调miRNA-613 表达对MDA-MB-231 细胞侵袭和迁移能力的影响

miRNA-613模拟物组细胞侵袭和迁移细胞数目均明显少于NC-模拟物组（P＜0.05，图4）。

2.5 miRNA-613对靶基因SOX9的验证

miRNA 在线靶基因预测网站TargetScan 和miRanda显示miRNA-613存在能靶向结合SOX9的3'UTR，双荧光素酶报告实验检测结果显示共转染miRNA-613模拟物进入MDA-MB-231 细胞后，可显著降低野生型pMIR-SOX9-WT 的荧光素酶活性（P＜0.05），而不能抑制突变型pMIR-SOX9-Mut的荧光素酶活性（P＞0.05，图5）。

2.6 上调miRNA-613 表达对SOX9、β-catenin、Vi⁃mentin和E-Cadherin蛋白表达的影响

miRNA-613 模拟物组细胞中的SOX9、β-catenin和Vimentin蛋白表达水平明显低于NC-模拟物组（均P＜0.05，图6），而E-Cadherin 蛋白表达水平明显高于NC-模拟物组（P＜0.05，图6B）。

图3 CCK-8实验检测miRNA-613模拟物组上调miRNA-613表达对MDA-MB-231细胞增殖活性的影响

图4 Transwell实验检测miRNA-613模拟物组上调miRNA-613表达对MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力的影响

图5 miRNA-613靶基因的验证

图6 Western blot 检测miRNA-613模拟物组细胞中的相关蛋白表达水平

3 讨论

研究证实，miRNA-613 在恶性肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用［2-4］，但乳腺癌中miRNA-613的研究较少，并且作用机制尚不清楚。本研究发现，miRNA-613在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中表达显著降低，与已有研究结果一致［5-6］。本研究还发现，miRNA-613 在高侵袭转移性乳腺癌细胞系中的表达显著低于低侵袭转移性乳腺癌细胞系，并且miRNA-613表达与患者TNM分期和淋巴结转移有显著性相关，乳腺癌TNM 分期中的Ⅲ期患者组织中的miRNA-613表达明显低于Ⅰ+Ⅱ期患者，有淋巴结转移患者组织中的miRNA-613表达明显低于无淋巴结转移者，进一步提示miRNA-613 异常低表达可能与乳腺癌的侵袭转移及进展有关。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT）是恶性肿瘤侵袭转移的关键步骤。本研究发现，上调乳腺癌细胞中miRNA-613 表达能明显抑制肿瘤细胞的增殖活性、侵袭及迁移能力，同时Vi⁃mentin蛋白表达明显下降，E-Cadherin蛋白表达明显升高，提示miRNA-613 能通过调控EMT 影响乳腺癌细胞的侵袭及转移。本研究进一步通过生物信息学网站预测SOX9 可能是miRNA-613 下游靶向调控基因，并且在肝细胞癌［7］和胶质瘤［8］中也发现miRNA-613 通过靶向调控SOX9 抑制肿瘤细胞的增殖及转移。Xue等［9］研究发现，miRNA-613通过靶向调控SOX9 诱导胃癌细胞对顺铂的敏感性。本研究通过双荧光素酶报告实验证实，miRNA-613 能与SOX9 的3'UTR 特异性结合，Western blot 证实miR⁃NA-613 能负性调控SOX9 蛋白表达，证明SOX9 为miRNA-613 的直接调控靶基因。SOX9 是SOX 家族的重要成员之一，研究显示SOX9 在肿瘤中异常表达，与恶性肿瘤的发生、进展以及不良预后有关［10］。抑制乳腺癌细胞中的SOX9表达，能抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力及EMT 过程［11-12］。以上说明miRNA-613通过靶向调控SOX9表达影响EMT，从而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

Wnt/β-catenin信号通路是影响肿瘤细胞EMT的重要分子通路。研究发现，SOX9能通过Wnt/β-catenin通路影响肿瘤细胞EMT，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移能力［13-14］。本研究发现，上调乳腺癌细胞中miRNA-613表达，能显著抑制miRNA-613靶基因SOX9蛋白的表达，进一步降低Wnt/β-catenin通路的关键分子β-catenin蛋白表达，癌细胞增殖及侵袭迁移能力下降，EMT受到抑制。以上说明miRNA-613可通过调控SOX9、Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭转移及EMT。

综上所述，在乳腺癌组织和细胞中miRNA-613异常低表达，并且与乳腺癌的侵袭转移相关，miRNA-613可通过调控SOX9、Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭转移及EMT，为乳腺癌的靶向治疗提供新的研究方向。