AJUBA在口腔鳞癌中的表达和意义及其相关机制

姚晓峰 金锐 陶英杰 郭文宇

口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部常见的第二大高发恶性肿瘤，约占口腔颌面部恶性肿瘤的90%。OSCC是对于口腔中恶性肿瘤的统称，包括舌、牙龈、唇、颊、口底、软硬腭等部位发生的癌症，具有侵袭性强、易早期淋巴结转移的特点。AJUBA（ajuba LIM protein）基因位于人类染色体14q11.2［1］，蛋白结构与LIM 家族的其他成员相似，通过LIM 或者preLIM 结构与其他多种蛋白或DNA 结合，作为支架蛋白参与多种生物学过程，发挥多种生物学作用［2］。在肿瘤的发生发展中，AJUBA参与多种信号通路的调节。在恶性间皮瘤中，AJUBA 通过调控Hippo信号转导抑制细胞增殖［3］。此外，AJUBA通过加强β-catenin 和GSK-3β 之间的结合促进GSK-3β介导的β-catenin 磷酸化，从而对Wnt 信号通路进行负调节［4］。目前，AJUBA 在OSCC 中的研究鲜见报道，其在OSCC中的表达情况及对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响仍有待探究。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2010年2月至2015年12月天津医科大学肿瘤医院OSCC组织标本共120例。其中男性75例，女性45 例；年龄≤60 岁54 例，＞60 岁66 例；T1+T2 期73例，T3+T4期47例。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 石蜡包埋切片后，常规脱蜡，3%H2O2处理30 min，柠檬酸钠抗原修复，一抗4℃过夜孵育，加入二抗孵育30 min 后，DAB 显色，苏木素复染，脱水后中性树胶封片，采集图像并分析AJU⁃BA表达情况。根据阳性肿瘤细胞所占百分数进行阳性率评分，≤5%、5%～25%、25%～50%、≥50%分别计0～3 分；染色强度评分：无着色为0 分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3 分，两项评分相乘所得分数为最终评分。120 例OSCC 组织标本按评分升序排列，低表达60例，高表达60例。

1.2.2 RNA 提取与qPCR 采用Trizol 法提取28 对OSCC 及癌旁组织总RNA，定量后吸取1 μg RNA，通过逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA。通过SYBR Green mix 对cDNA 进行qPCR 实验，以GAPDH 作为内参，检测AJUBA及Snail的表达情况。

1.2.3 细胞培养 人OSCC细胞系Tca8113和TSCCA均购于中国科学院细胞库，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。

1.2.4 质粒及siRNA转染 OSCC细胞接种于6孔板中，融合度达70%～80%时，利用Lipofectamine 3000将2.5 μg质粒DNA转染至Tca8113和TSCCA细胞中。AJUBA特异性siRNA及阴性对照购于吉玛基因（苏州）。当6孔板中细胞融合度达40%时，采用RNAiMax转染30 pmol si-AJUBA至Tca8113和TSCCA细胞中，48 h后进行表达检测或功能实验研究。

1.2.5 MTT实验 将OSCC细胞消化计数后，接种于96 孔板中（1×103个细胞/孔）。分别于第1、2、3、4、5天采用MTT法检测细胞增殖情况。具体步骤：100 μL培养基加入10 μL MTT 溶液，37℃孵育4 h 后吸去上清，加入150 μL DMSO 室温孵育10 min，490 nm 波长检测OD并分析。

1.2.6 Western blot 将OSCC 细胞用PBS 清洗2 遍，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃离心15 min，收集上清采用BCA 法进行蛋白定量。蛋白变性后，SDS-PAGE电泳。转膜完成后，5%脱脂牛奶封闭1 h，相应一抗4℃过夜孵育。TBST 洗涤3 次后，加入相应二抗室温孵育1 h，ECL化学发光法曝光检测蛋白的表达情况。

1.2.7 克隆形成实验 Tca8113和TSCCA细胞接种于6孔板中（5×102个细胞/孔），培养14 d后，冰甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色，PBS清洗后，采集图像并计数。

1.2.8 划痕实验 OSCC细胞消化后铺于6孔板中，当细胞融合度约100%时，使用10 μL 移液枪枪头对孔中细胞划痕，PBS清洗以去除脱落细胞。24 h后采集图像，并采用Image J 图像处理软件对细胞迁移面积进行分析。

1.2.9 Tranwell 实验 OSCC 细胞消化后用无血清培养基重悬，计数后加入已预铺好Matrigel 的Transwell小室中，小室下方加入600 μL含20%胎牛血清的RP⁃MI 1640 培养基。培养24 h 后，用棉签擦拭掉小室膜上方细胞，甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色，PBS清洗后采集图像并分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，数据以表示，实验数据通过3次独立实验获得。两组样本间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AJUBA在OSCC组织中的表达及与预后的关系

通过qPCR 检测及TCGA 数据库分析发现，AJU⁃BA 在OSCC 组织中的表达水平显著升高（图1A，1B）。免疫组织化学法结果显示OSCC组织中AJUBA表达显著高于癌旁正常组织（图1C）。同时发现AJU⁃BA表达与OSCC的T分期、淋巴结转移及复发呈正相关，其表达越高，肿瘤分化越差（表1）。与AJUBA 低表达患者相比，AJUBA 高表达患者的预后相对较差（图1D，P=0.019）。

表1 AJUBA表达与OSCC临床病理指标的关系

2.2 AJUBA对OSCC细胞的增殖和侵袭

在Tca8113 和TSCCA 中敲降AJUBA 后，肿瘤细胞的增殖能力受到显著削弱（图2A）。通过克隆形成实验发现敲降AJUBA 能够抑制Tca8113和TSCCA 细胞的克隆形成（图2B）。此外，与阴性对照组相比，si-AJUBA 组的划痕面积较大，表明AJUBA 表达下调能够导致OSCC 细胞的迁移能力降低（图2C）。随后进行Transwell 实验进一步探究AJUBA 对OSCC 细胞侵袭的影响。结果显示敲降AJUBA 后，Transwell 小室膜下方的肿瘤细胞数显著减少，OSCC 细胞的侵袭能力受到显著抑制（图2D）。

2.3 AJUBA对OSCC细胞Snail表达的影响

Western blot检测结果表明，过表达AJUBA后，OSCC细胞中Snail表达升高，同时N-cadherin和Vimentin表达增加，E-cadherin表达下降。而敲减AJUBA导致Snail、N-cadherin和Vimentin表达降低，E-cadherin表达上调（图3）。以上结果表明AJUBA可能通过调控Snail影响OSCC的上皮间质转化。

2.4 OSCC中AJUBA与Snail的相关关系

通过qPCR检测发现，OSCC组织中的Snail mRNA水平显著高于正常组织（图4A，P=0.00 1）。Spearman相关性分析显示AJUBA与Snail表达呈正相关（图4B，P=0.001）。通过TCGA数据库分析发现Snail表达升高，提示OSCC患者预后不良（图4C）。

图1 AJUBA在OSCC中高表达及预后

图2 AJUBA对OSCC细胞的增殖和侵袭

图3 AJUBA对OSCC细胞Snail及下游蛋白表达的影响

图4 Snail在OSCC中的表达及与AJUBA表达的相关关系

3 讨论

研究表明AJUBA 能够促进多种肿瘤进展，AJU⁃BA可与SP1形成复合体，诱导下游基因表达，促进胰腺癌的增殖［5］。在食管鳞癌中，AJUBA能够通过上调MMP10 和MMP13 的表达从而增强肿瘤细胞的运动侵袭能力［6］。然而也有证据显示，AJUBA可以通过调控β-catenin 和YAP 通路，抑制肝癌细胞生长从而发挥抑癌基因的作用［7］。这可能与不同的细胞背景有关［8］。目前，AJUBA 在OSCC 中的研究较少，其发挥的功能及相关调控机制仍有待探究。本研究首先检测AJUBA 在OSCC 中的表达情况，结果显示AJUBA在OSCC中显著高表达，并且提示不良预后。因此推断AJUBA可能促进OSCC进展。

此外，免疫组织化学法结果显示AJUBA 的表达与T 分期及淋巴结转移呈正相关，因此AJUBA 可能在OSCC 的增殖和侵袭过程中发挥重要作用。通过功能实验发现敲降AJUBA 能够显著抑制OSCC 细胞的增殖和侵袭能力。这充分证实了AJUBA 在OSCC中发挥着促癌基因的作用，而AJUBA 调控的具体机制则需进一步探究。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT）是上皮细胞获得间质表型或成纤维样特性时出现的暂时、可逆的生物学过程［9］，解释了肿瘤转移的起始步骤，在肿瘤研究中受到越来越多的关注［10］。EMT发生后，上皮细胞失去极性、细胞间连接降解、细胞骨架结构重组、细胞形态改变，而这些改变使细胞获得了更高的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力［11］。因此，本研究进一步检测AJUBA对OS⁃CC 细胞EMT 的影响，发现敲减AJUBA 后，上皮样标志物E-cadherin 表达上调，而间质样标志物Vimentin及N-cadherin 表达下降，这表明AJUBA 能够通过调控EMT发生而促进OSCC的侵袭转移。

大量研究表明Snail是调控EMT过程的重要转录因子，在多种肿瘤中（如胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、OSCC 及恶性黑色素瘤等）均可转录抑制E-cadherin的表达来促进EMT 的发生［12-14］。本研究发现敲降AJUBA 能够抑制Snail 的表达，同时在OSCC 中，两者的表达呈正相关。因此本研究提示，AJUBA 通过影响Snail 表达从而下调E-cadherin 并促进EMT 的发生。但AJUBA 与Snail 之间的具体调控机制仍值得深入发掘。

综上所述，本研究发现AJUBA 在OSCC 中高表达，且提示不良预后。AJUBA能够调控Snail表达，从而影响OSCC的细胞增殖、侵袭及EMT发生。本研究初步揭示了AJUBA在OSCC中的功能及调控机制，为OSCC的临床诊疗提供了理论依据和新的思路。