林元益阳胶囊对小鼠补肾益阳作用的实验研究

姜姗姗，石敏娟，惠爱武，杨 洁， 赵 岗，张晓凤，袁秋贞

陕西省中医医院(西安 710003)

林元益阳胶囊来源于临床经验方，验之临床取得了很好疗效。其功能为补肾益阳，生精填髓。主治肾阳不足，男子精液稀薄，经久不育。为探索本方的作用机理，本研究建立了小鼠肾阳虚模型。观察林元益阳胶囊对肾阳虚模型小鼠的影响，及其对正常雄性小鼠交配能力和精子数的影响，进一步验证其药理作用，为本品临床应用提供实验依据。

材料与方法

1 主要仪器 YP1201N电子天平(上海精密仪器有限公司)；AL104型万分之一分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；MC-106B电子体温计(欧姆龙工贸大连有限公司)；YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(济南益燕科技发展有限公司)；计时秒表(中国卡西欧有限责任公司)；红外摄像机(台湾多安科技有限公司)；iMark酶标仪(Bole Life Medical Products Co.，Ltd)；E200光学显微镜(日本尼康仪器有限公司)。

2 药品与试剂 林元益阳胶囊(批号：160420)西安雁塔藻露堂中医院提供。甲睾酮片(国药准字H31020637)购自上海信宜康捷药业有限公司。氢化可的松注射液(国药准字H61021633)购自西安利君制药有限公司。己烯雌酚片(国药准字H34021250)购自合肥久联制药有限公司。环磷酸腺苷，环磷酸鸟苷酶联免疫吸附试剂盒(批号为：20170309100723，20170309100724，20170309100725)购自上海骞亿生物科技有限公司。

3 实验动物 SPF级KM小鼠，体重18～22 g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，实验动物质量许可证号：SCXK(陕)2012-003。

4 实验方法

4.1 对肾阳虚模型小鼠的作用

4.1.1 造模与给药：雄性小鼠60只，随机分为6组。正常对照组，模型对照组，甲睾酮片组，林元益阳胶囊大、中、小剂量组，每组10只。正常对照组肌肉注射0.9%氯化钠注射液，其余各组肌肉注射氢化可的松25 mg/kg，1次/d，连续14 d，制备肾阳虚模型[1]。灌胃给药于第15天开始，1次/d。正常对照组和模型对照组给予10 ml/kg去离子水；阳性对照组给予1 mg / kg甲基睾酮片； 林元益阳胶囊大、中、小剂量组分别给予2.775、1.388、0.694 g/ kg的药物，1次/d，连续14 d。

4.1.2 动物一般体征的观察：观察各组小鼠的体重，肛温等一般身体状况及小鼠自主活动情况。小鼠自主活动的测试：最后一次给药后1 h后，将小鼠置于自主活动记录仪中安静适应5 min后，测量10 min内小鼠的自发活动次数。

4.1.3 指标检测：于小鼠自主活动观察实验结束后，用乙醚麻醉实验小鼠，打开腹腔，腹主动脉进行取血，称重小鼠睾丸、附睾、精囊和前列腺，并计算脏器系数，脏器系数=脏器湿重(g)/体重(g)×1000。通过3500 r/min离心10 min分离血清，并且根据酶联免疫吸附试剂盒的说明测量环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)含量，并计算cAMP / cGMP值[2]。

4.2 对正常小鼠交配能力和精子的影响[3]

4.2.1 分组及给药:按交配能力将60只18～22 g的雄性小鼠随机分成5组。正常对照组，甲睾酮片组，林元益阳胶囊大、中、小剂量组，每组12只。 正常对照组给予10 ml/kg去离子水灌胃；阳性对照组给予1 mg/kg甲基睾酮片灌胃；林元益阳胶囊大、中小剂量组分别以2.775 g/kg，1.388 g/kg和0.694 g/kg的剂量灌胃给药。1次/d，连续14 d。

4.2.2 交配能力检测：取70只18～22 g的雌性小鼠，于交配实验开始前3天给每只雌鼠灌胃0.4 mg/kg的己烯雌酚悬浮液，1次/d，将发情时间与交配时间同步。在最后一次给药后，选择进入发情期的雌性小鼠进行实验。夜间进行交配实验，每笼放入一只雄鼠适应环境5 min，然后放入一只雌性小鼠。用红外摄像机记录捕捉潜伏期(自雌鼠投入到第一次雄鼠捕捉雌鼠的时间)及捕捉次数(自雌鼠投入20 min内雄鼠捕捉雌鼠的次数)。

4.2.3 对正常小鼠精子的影响[4]：在交配实验结束24 h后，分离取出右侧附睾，将其装入1 ml无菌磷酸盐缓冲液(0.15 mmol/ L， pH7.2)中剪碎，反复洗涤，37°C下孵育30 min，即为附睾精子悬液。移取一滴精子到载玻片上，立即在显微镜下观察，计数200个精子中的活精子数，计算活率。同时，将20 μl精子悬浮液加入到0.38 ml(20倍稀释)精子固定液中，摇匀，然后用滴管吸出。填充到白细胞计数池中，通过白细胞计数法计数精子。

结 果

1 动物的一般状态观察 与其他各组相比，正常对照组小鼠体形偏大，被毛光滑干爽，精神状态佳。造模后，小鼠体重减轻，被毛凌乱少泽，反应迟缓，肢凉尾冷，喜弓背蜷缩，少食少饮，与临床肾阳虚症状相似。用药后，上述肾阳虚症状均得到明显的缓解。

造模后，各组小鼠体重明显低于正常对照组(P<0.01)。经药物治疗后，甲睾酮片和林元益阳胶囊大剂量组的体重明显高于模型对照组(P<0.05)。各组体重变化见表1。

2 林元益阳胶囊对模型小鼠自主活动的影响 见表2。肾阳虚模型组小鼠自发活动次数明显低于正常对照组(P<0.01)。林元益阳胶囊大，中剂量组小鼠自发活动次数明显高于模型对照组(分别为P<0.05、P<0.01、P<0.05)。

3 林元益阳胶囊对肾阳虚小鼠体温的影响 见表3。在造模前，造模的第14天和给药的第14天，用电子体温计测量体温，模型对照组小鼠的肛温显著降低。经药物干预后，甲睾酮片、林元益阳胶囊大剂量组小鼠肛温明显高于模型对照组(P<0.05)。提示其可明显升高肾阳虚小鼠体温。

表1 林元益阳胶囊对各组模型小鼠体重的影响(g)

注：与正常对照组比较,▲P<0.01;与模型对照组比较,*P<0.05

表2 林元益阳胶囊对各组模型小鼠自主活动的影响(次/10 min)

注：与正常对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较，*P<0.05，◇P<0.01

4 林元益阳胶囊对模型小鼠脏器指数的影响 见表4。与正常对照组相比，肾阳虚模型组小鼠的睾丸及附睾指数显著降低(P<0.05)。甲基睾酮片组(P<0.01)、林元益阳胶囊大(P<0.01)、中(P<0.01)、小(P<0.05)剂量组能显著增加模型小鼠的睾丸指数。林元益阳胶囊大、中剂量组和甲睾酮片组使阳虚小鼠附睾指数显著升高(分别为P<0.01、P<0.05、P<0.01)。

表3 林元益阳胶囊对各组肾阳虚模型小鼠体温的影响(℃)

注：与正常对照组比较,△P<0.05，▲P<0.01;与模型对照组比较,*P<0.05

表4 林元益阳胶囊对各组模型小鼠生殖器官指数的影响(mg/g)

注：与正常对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05，◇P<0.01

5 林元益阳胶囊对模型小鼠血清cAMP/cGMP值的影响 见表5。模型对照组与正常对照组相比，血清cAMP显著降低(P<0.01)，cGMP显著升高(P<0.01)，cAMP/ cGMP值明显减小(P<0.01)；甲睾酮片和林元益阳胶囊高剂量组与模型对照组相比，cAMP显著增加(分别为P<0.05和P<0.01)。甲睾酮片组、林元益阳胶囊组与模型对照组相比，cGMP水平显著降低(P<0.01)。甲睾酮片组、林元益阳胶囊大、中剂量组与模型对照组相比，cAMP/cGMP值明显增加(P<0.01)，林元益阳胶囊小剂量组显著增加(P<0.05)。与正常对照组相比，甲睾酮片组与林元益阳胶囊大剂量组的cAMP/cGMP值无统计学差异。

表5 林元益阳胶囊对各组模型小鼠血清cAMP、cGMP及其比值的影响

注：与正常对照组比较,△P<0.05，▲P<0.01;与模型对照组比较,*P<0.05，◇P<0.01

6 林元益阳胶囊对正常小鼠交配能力的影响 见表6。与正常组相比，甲基睾酮片组小鼠捕捉潜伏期显著缩短，次数明显增加(P<0.01)；与正常组相比，林元益阳胶囊各剂量组小鼠的捕捉潜伏期缩短，其中大剂量组有统计学意义(P<0.05)。此外，林元益阳胶囊大、中剂量组也可以提高捕捉次数及捕捉率，但无统计学意义。

表6 林元益阳胶囊对各组正常小鼠交配能力的影响

注：与正常对照组比较,*P<0.05，◇P<0.01

7 林元益阳胶囊对正常雄性小鼠精子的影响 结果表明，林元益阳大、中、小剂量组和甲睾酮片显著增加了小鼠附睾精子的数量(P<0.01)。精子存活率明显提高(林元益阳小剂量组P<0.05，其他组P<0.01)。

表7 林元益阳胶囊对各组正常雄性小鼠精子的影响

注:与正常对照组比较，*P<0.05，◇P<0.01

以上研究提示，林元益阳胶囊能显著改善肾阳虚小鼠的肾阳虚状态，并能显著增加阳虚小鼠的体重、体温和自发活动次数。它可以显著提高肾阳虚模型小鼠的睾丸指数和附睾指数，提示该药品对由氢化可的松引起的性器官萎缩有明显的保护作用。正常雄性小鼠应用林元益阳胶囊干预14 d后，附睾精子数量显著增加，精子存活率显著提高。

讨 论

祖国医学称肾为“先天之本”，藏先天之精，主生殖。肾阳虚为体内肾阳不足，温煦、推动、兴奋功能减退，临床以肢冷、畏寒、腰膝酸软、阳痿早泄等为主要表现的证候[5]。

现代研究证实，“肾阳虚”与下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴，甲状腺轴和性腺轴的紊乱关系密切[6]。在该实验中，肌肉注射外源性糖皮质激素氢化可的松复制肾阳虚小鼠模型[7]。造模后，小鼠表现出体重和体温下降，被毛疏松，精神倦怠，弓背蜷缩，肢凉尾冷，大便溏泄，自主活动减少等明显的“阳虚体征”。实验结果表明，林元益阳胶囊可以改善外源性糖皮质激素导致的肾阳虚症状，增加模型小鼠体重和自主活动次数、升高肛温。

机体多种生理、病理过程都有第二信使的参与，其中环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)具有广泛的生物学效应[8]。 生物学家Goldberg[9]认为cAMP和cGMP参与细胞反应的调节，并且通常具有拮抗作用，这种拮抗调节作用可用“阴”和“阳”来概括。在此基础上，提出了生物控制二元论，即阴阳学说。 cAMP和cGMP的相对平衡有益于维持机体的稳定生理状态[10]。在该实验中，模型对照组的 cAMP显著降低， cGMP显著增加，并且 cAMP/ cGMP显著降低， 表明环核苷酸系统在具有肾阳虚症状的小鼠中体内的反应性是失衡的，也是肾上腺皮质系统受到抑制的另一种表现。 从中医角度来讲是由于肾的阳气不足导致推动、温煦各个组织器官的动力减弱，不能进行温养肾气的作用，从而引起的细胞代谢功能的紊乱。 给予林元益阳胶囊后，血清cGMP含量显著降低，cAMP/cGMP比值显著升高，提示林元益阳胶囊可以改善机体能量代谢的紊乱低下状态。

中医认为，肾主生殖，人体生殖功能与肾气盛衰密切相关。肾精不足，肾阳虚衰会影响人的生殖功能，表现为阳痿，早泄等性功能障碍的症状[11]。

性腺和性器官的发育和成熟具有维持第二性征和正常性功能的作用。一旦性腺组织萎缩或减轻，由其分泌的性激素量会明显减少，导致性功能衰退或紊乱[12]。因此，动物生殖器官重量的变化可以反映药物对雄激素的影响[13]。结果显示，氢化可的松造模的小鼠睾丸和附睾的器官指数降低。经林元益阳胶囊灌胃后，各剂量组小鼠睾丸器官指数增大，大、中剂量组附睾器官指数增大。

交配实验测量小鼠的捕捉潜伏期，捕捉次数，捕捉率和射精率。这些性功能的主要评价指标可以表明实验药物是否具有改善动物性功能的作用[14]。实验结果表明，与正常对照组相比，林元益阳大剂量组的捕捉潜伏期明显缩短。林元益阳大、中剂量组的捕捉次数增加，但无统计学意义。精子密度也是评估生育能力的重要指标[15]。正常小鼠灌胃给予林元益阳胶囊14 d后，各剂量组小鼠的附睾精子数量均明显增加，精子存活率有所提高。

综上所述，林元益阳胶囊能改善肾阳虚模型小鼠肾阳虚症状，增强正常小鼠的交配能力，具有补肾益阳的功效。近年来研究表明，肾阳虚证与细胞、体液、分子免疫等具有一定相关性[16]。本研究前期预实验也证实林元益阳胶囊能明显改善小鼠胸腺萎缩情况，故此后将进一步研究探讨林元益阳胶囊在免疫学方面对肾阳虚的作用机理。