鸦胆子素D对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡及细胞周期的影响*

张 贺，姜大庆

1.辽宁中医药大学第一临床学院2017级硕士研究生 (沈阳 110167)；2.辽宁省肿瘤医院乳腺外科(沈阳 110042)

乳腺癌作为女性最常见的癌症诊断及死因，其发病率已占全球癌症新发病例的11.6%[1-3]。鸦胆子，又称苦参子、老鸦胆，为苦木科植物鸦胆子[Brucea javanica (L.)Merr.]的干燥成熟果实，为治疗癌症常用中药材。鸦胆子素D(Bruceine D，BD)是从中药鸦胆子中分离提取的一种水溶性三环四萜类化合物。已有证据表明BD在肝癌、胰腺癌及慢性粒细胞白血病中有抑制癌细胞增殖的作用,BD通过调节microRNA-95发挥其对HCC的抗癌活性，通过p38-MAPK及NF-kB途径促进胰腺癌凋亡[4-5]。Zhang JY等亦发现BD可通过线粒体途径诱导白血病K562细胞凋亡[6]。但其对乳腺癌的影响尚未报道，故本实验研究其对MDA-MB-231细胞株抗癌活性，并探讨其可能机制及通路，以期为乳腺癌开发新药提供思路。

材料与方法

1 试 剂 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中科院上海细胞库。鸦胆子素D(CAS:21499-66-1，20mg，HPLC≥98%，货号：B21415)购自上海源叶生物科技有限公司。1640培养液(RPMI 1640)、DMEM培养液购于Hyclone公司；胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、PBS(磷酸盐缓冲液)购于Genvew公司；胎牛血清(FBS)购于Clark公司；CCK-8试剂购于Vazyme公司；碘化丙锭溶液购于北京鼎国盛生物技术有限公司；凋亡试剂盒购于碧云天有限公司、RIPA裂解液购于中国上海碧云天生物技术有限公司。

2 仪 器 CO2培养箱(Thermo-371，德国 Thermo scientific 公司)、超净台(DL-CJ-2N，苏州安泰空气技术有限公司)、荧光显微镜(LeicaDMi8，德国Leica公司)、离心机(Centrifμge 5804R，德国 Eppendorf 公司)、流式细胞仪(FACSAriall，美国BD公司)。

3 方 法

3.1 溶药：BD用DMSO溶解后，配成20 mmol/L的母液分装，置于-20℃冰箱冷藏备用。

3.2 细胞培养： MDA-MB-231细胞株置于含10%胎牛血清、1×108U/L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO2的恒温细胞孵育箱中连续培养。每2～3天胰酶消化传代。

3.3 CCK8法检测细胞活性： 取对数生长期MDA-MB-231细胞，按6000个/孔铺96孔板，3个板均孵育24 h。 母液稀释配药，不同浓度BD(0、3、5、10、30、50 μmol/L)，每组5个复孔加药。标记号码及时间，分别孵育24、48、72 h。 每孔加10 μl CCK-8，37 ℃孵育4 h酶标仪检测，波长在450 nm测各孔吸光度值，实验重复3次，计算IC50。

3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡：取对数生长期MDA-MB-231细胞，按1.5× 105个/孔接种至六孔板，孵育24 h。根据上述IC50值(28 μmol/L)，加入(0、10、30、50 μmol/L)的BD，作用24 h后消化离心，预冷PBS冲洗后，100 μl 1×缓冲液重悬细胞。 蒸馏水按4∶1比例稀释5× Annexin V结合缓冲液，用1×结合缓冲液10∶1比例稀释PI。 每管加入3 μl的FITC-Annexin V和2 μl的PI，室温避光孵育15 min。 每管加400 μl的1×结合缓冲液，流式细胞仪检测，FlowJo V10软性分析，实验重复3次，计算细胞凋亡率。

3.5 流式细胞仪检测细胞周期：取对数生长期MDA-MB-231细胞，按1.5× 105个/孔接种至六孔板，设置空白对照组，PI阴性对照组，0、10、30、50 μmol/L的BD组，孵育24 h。 加入1 ml冰浴预冷的70%乙醇，4℃固定12 h。 每管加入0.5 ml碘化丙啶染色液，37 ℃避光温浴30 min后4 ℃冰浴避光存放，流式细胞仪检测，CellQuest软件分析结果。实验重复3次。

4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件处理实验数据，结果以均值±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度鸦胆子素D对乳腺癌细胞增殖的影响 不同浓度BD(0、3、5、10、30、50 μmol/L)分别作用24、48、72 h后MDA-MB-231细胞存活率如表1所示。可见相同时间随药物浓度增加，细胞存活率降低；且相同浓度随作用时间增加，细胞存活率降低。24、48及72 h的IC50值分别为28、13、7 μmol/L即BD抑制乳腺癌细胞增殖呈时间剂量依赖性，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同浓度鸦胆子素D对乳腺癌细胞增殖的影响

注：与对照组0 μmol/L相比，各项均P<0.05

2 不同浓度鸦胆子素D对乳腺癌细胞凋亡的影响 采用含0、10、30、50 μmol/L的BD处理MDA-MA-231细胞24 h后，如表2所示。总细胞群中凋亡细胞的百分比分别为6.69%、15.12%、35.83%和40.67%，与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。表明BD剂量依赖性的诱导MBA-MB-231细胞凋亡。

表2 不同浓度鸦胆子素D对乳腺癌细胞凋亡的影响

注：与对照组0 μmol/L相比，各项均P<0.05

3 不同浓度鸦胆子素D对乳腺癌细胞周期的影响 用含0、10、30、50 μmol/L的BD处理MDA-MA-231细胞24 h后，流式细胞仪分析检测其各周期占比。如表3所示，BD以剂量依赖性诱导G0/G1期的MDA-MA-231细胞的百分比增加，经0、10、30、50 μmol/L的BD作用24 h后，G0/G1期的乳腺癌细胞占比分别为31.45%、40.93%、 57.16%、 66.38%。可见随药物浓度增加，处于G0/G1期的细胞比例逐渐增加，G2/M期的细胞比例下降，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 不同浓度鸦胆子素D对乳腺癌细胞周期的影响

注：与对照组0 μmol/L相比，各项均P<0.05

讨 论

鸦胆子首载于清代医学家赵学敏的《本草纲目拾遗》中，具有清热解毒，杀虫截疟的功效。现代鸦胆子主要用于抗肿瘤、增强免疫、抗疟等领域。南新记等研究发现鸦胆子油注射液对激素抵抗性前列腺癌VEGF C及血清PSA水平均有明显影响，且显著降低其化疗后不良反应[7]。王立军等在鸦胆子甲醇提取物中分离出11种化合物，其中鸦胆子内酯A和鸦胆子素D对癌细胞株有明显抗癌作用[8]。Liu等发现BD在胰腺癌中对Panc-1、SW1990及Capan-1等多种细胞系均存在很强的细胞毒作用,且其研究表明BD的抗增殖作用与吉西他滨及喜树碱相当，BD以剂量依赖性增加subG1期的Capan-2细胞百分比，表明BD通过线粒体途径诱导胰腺癌细胞凋亡[9]。Cheng等研究发现BD显著抑制肝肿瘤细胞生长并增强索拉菲尼在大鼠HCC中的治疗效果，其机制为BD促进β-连环蛋白的蛋白酶体降解和其核积累的消耗，反过来破坏HCC中Notch配体Jagged1的Wnt/β-连环蛋白依赖性转录[10]。学者们发现鸦胆子素D可抑制HPV 16 E6、HPV 16 E7 mRNA的表达，抑制HPV 16细胞增殖，BD诱导癌细胞凋亡的机制与JNK蛋白相关[11-13]。安改丽等研究发现miR-145可通过抑制Bcl-2和P-gp蛋白的表达来增加MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性和凋亡[14]。

已知细胞凋亡是细胞生长抑制的主要途径，其涉及一系列基因的激活、表达与调控。在哺乳动物细胞中，导致细胞凋亡的级联反应分两大类，即内源性途径和外源性途径。内源性途径亦称为线粒体途径，包括线粒体在执行凋亡程序的半胱天冬酶级联起始中的作用[15]。本研究阐明BD诱导MDA-MB-231细胞凋亡是其抑制乳腺癌细胞生长的主要机制，后续实验室将进一步明确BD促进乳腺癌细胞凋亡的具体机制。