CRISPR/Cas9介导敲除小鼠成纤维细胞MMP-2基因

2019-11-11接金磊张青青李鹏辉刘焕奇

中国兽医杂志 2019年6期

接金磊,迟良,张青青,李鹏辉,刘焕奇

(青岛农业大学动物医学院，山东青岛266109)

MMP-2(金属基质蛋白酶-2)是一种重要的炎性介质，能够参与多种疾病的发展过程[1]。炎症早期释放的TNF-α和IL-6等炎性介质能够促进MMP-2的表达[2，3]，而过表达的MMP-2可降解细胞外基质，破坏基膜，使炎性细胞进一步浸润到更深层次的组织中，出现肌纤维坏死及吞噬现象等一系列病理炎症改变，从而加重炎性反应[4]。另外，肿瘤细胞也可因基膜的破坏、细胞外基质的溶解发生转移[5]。

近几年有研究表明[6]，金属基质蛋白酶-2(MMP-2)在蹄叶炎的早期发展阶段中起着重要作用，基质金属蛋白酶能催化降解基底膜、半桥粒等重要结构，最终使基底膜和上皮基部细胞分离，使薄膜组织失去其生物学功能[7]，造成指(趾)损伤，并发现P38 MAPK有利于MMP-2的活化[8]，其下游通过PI3K/Akt使半桥粒调节异常，粘附功能失常[9]，对蹄叶炎具有强大的促进作用。并有大量研究[10-12]表明，在蹄叶炎的早期炎症是主要的病理变化，这些变化包括：激活蹄层状基质金属蛋白酶(MMPs)、活化血小板并且形成嗜中性粒细胞血小板聚集、蹄叶层的白介素-1(IL-1)和内皮素1表达增加、p38 MAPK表达增加等。其中被激活的白细胞和血小板会释放TNF-α和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，p38 MAPK能够激活MMP-2，从而对蹄叶层造成破坏，促进蹄叶炎的发生。

随着奶牛养殖业的高速发展，奶牛蹄叶炎也越来越多。据统计，41%的肢蹄病是蹄叶炎，72%的奶牛至少有一个蹄发生过蹄叶炎[13]。并且在实际情况中，对急性蹄叶炎的及时治疗是不切实际的，因为在其造成损伤前确诊是不可能的。当奶牛发展到慢性蹄叶炎时康复的几率很小，到目前为止还没有确切诊断蹄叶炎的基因检测指标，往往在症状上发现蹄叶炎症状时该奶牛已经面临淘汰危险。因此，开展对奶牛蹄叶炎病因、发病机理、诊断和防治等方面的研究，对防治奶牛蹄叶炎、提高奶牛生产性能具有重要的实用价值和现实意义[14]。

CRISPR/Cas9系统是一种存在于细菌和古细菌中针对外来入侵的免疫防御系统，能够识别外来入侵的核酸物质并形成针对性的剪切，以此来抵抗入侵的病毒以及外源DNA[15]。该技术操作简单、适用范围广[16]，可以对特定的基因进行编辑，并且效率很高，在基因功能研究、模式生物构建、新品种的改造和培育以及基因治疗等方面均有研究[17]。本试验目的是通过利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠成纤维细胞中的MMP-2基因，为后人研究MMP-2与蹄叶炎炎症提供理论基础，对蹄叶炎等炎症性疾病的治疗预防和快速诊断具有重要意义，并为寻找分子指标的变化与蹄叶炎的关系，从而进行准确诊断和早期预警提供理论基础和技术标准。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒 Lenticrispr v2载体，购自Addgene公司；Stbl3感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 试剂限制性内切酶 Esp3I和FastAP，均购自Thermo公司；二硫苏糖醇 DTT，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4多聚核苷酸激酶和Quick Ligase连接酶，均购自NEB公司；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，均购自TaKaRa公司；2×TaqPCR Master Mix，购自北京艾德莱生物科技有限公司；青链霉素，购自Solarbio公司；DMEM-F12，购自HyClone公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒和碱性磷酸酶显色试剂盒，购自贝博生物有限公司。

1.3 sgRNA的设计与相关引物的合成根据MMP-2的基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_008610.3)利用在线sgRNA设计工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计MMP-2的sgRNA(small guide RNA)，并在序列正义链和反义链的5′端添加Esp3I酶切位点(CACC/AAAC)，设计的sgRNA引物分别为：MMP-sgRNA2-F：5′-caccGGCGATGGTGCAGCGATGGCG-3′；MMP-sgRNA2-R：5′-aaacCGCCATCGCTGCACCATCGCC-3′；MMP-sgRNA3-F： 5′-caccGTGGTAAACAAGGCTTCATGG-3′；MMP-sgR NA3-R：5′-aaacCCATGAAGCCTTGTTTACCAC-3′。sgRNA 的磷酸化与退火反应体系为：100 μmol/L Oligo1 1 μL、100 μmol/L Oligo 21 μL、10×T4 Ligation Buffer 1 μL、ddH2O 6.5 μL、T4 PNK 0.5 μL，共10 μL体系。反应条件为：37 ℃ 3 min，90 ℃ 5 min，再放置室温下，自动冷却至25 ℃。最终退火的寡核苷酸用无菌水以1∶200倍稀释，-20 ℃储存备用。

1.4 lenticrispr v2载体酶切用Esp3I限制性内切酶切割Lenticrispr v2质粒，酶切体系为：Lenticrispr v2 5 μg、Esp3I 3 μL、Fast AP 3 μL、10×Fast Digest Buffer 6 μL、100 mol/L DTT 0.6 μL、ddH2O X μL，共60 μL体系。反应条件为：37 ℃水浴0.5～1 h。将酶切产物进行电泳检测，切胶回收酶切后的载体。

1.5 Lenticrispr-sgRNA载体构建把退火之后200倍稀释的DNA片段与酶切后胶回收的载体相连接。连接反应体系为：酶切载体1 μL、DNA片段1 μL、2×Quick Ligase Buffer 5 μL、ddH2O 3 μL、Quick Ligase 1 μL，共11 μL体系。反应条件为：25 ℃孵育30 min。将连接产物转化感受态细胞stbl3，涂于含有氨苄抗性的LB平板，37 ℃过夜培养，挑取单克隆进行菌液PCR检测，检测引物为：V2-JC2-F：5′-GCCTATTTCCCATGATTCCTTC-3′；V2-JC2-R：5′-ACATCACTTTCCCAGTTTACCC-3′。菌液PCR体系为：菌液 2 μL、2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL、v2-JC2-F 0.5 μL、v2-JC2-R 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL，共25 μL体系。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。将阳性PCR反应液送公司测序，提取质粒。

1.6 转染及Western Blot 检测转染前1天，将小鼠成纤维细胞接种于六孔板，加入2 mL含10%胎牛血清不含双抗培养基；取4支无菌离心管，分别加入200 μL无血清无双抗培养基，再向1号离心管中加入15 μL生理盐水；2、3号离心管中分别加入3 μg构建好的Lenticrispr-sgRNA2、Lenticrispr-sgRNA3载体；向4号离心管中加入相同量的Lenticrispr v2质粒；最后在上述4个离心管中分别加入9 μL转染试剂，室温孵育15 min。将上述混合液加入六孔板中，48 h后更换为含有1 μg/mL嘌呤霉素10%胎牛血清不含双抗的培养基，37 ℃培养24 h。提取细胞蛋白，做Western Blot 检测MMP-2蛋白表达量。

2 结果

2.1 Lenticrispr v2载体的酶切 Lenticrispr v2质粒长度为14 873 bp，用Esp3I限制性内切酶切割Lenticrispr v2质粒，可以切割下1个2 000 bp左右大小的条带。由图1可以看出，将酶切反应液进行凝胶电泳后，发现2个条带，其中1条2 000 bp左右与预测的结果相符。

图1 lenticrispr v2载体酶切鉴定

1: Lenticrispr v2原质粒； 2：Lenticrispr v2质粒酶切，切胶回收后；3：Lenticrispr v2质粒酶切后； M1、M2：DNA相对分子质量标准

2.2 Lenticrispr-sgRNA载体构建 DNA片段与酶切后胶回收的载体相连接，如封三彩版图2。

2.3 阳性克隆鉴定挑去阳性菌落进行菌液PCR，并将PCR体系进行凝胶电泳鉴定，发现500 bp左右的目的条带，结果如图3所示，与预测的结果相符。

图3 阳性菌落PCR鉴定

M: DNA相对分子质量标准； 1、2：阳性菌落PCR反应液

2.4 测序结果将PCR产物送至公司测序，得到产物序列，含有sgRNA：

Lenticrispr-sgRNA2：5′-…ACGAAACACCGGCGATGGTGCAGCGATGGCGGTTTTA…-3′

Lenticrispr-sgRNA3：5′-…ACGAAACACCGTGGTAAACAAGGCTTCATGGGTTTTA…-3′

2.5 转染结果由封三彩版图4可见，经嘌呤霉素筛选后1组(对照组)细胞全死，2、3、4组细胞生长良好，表明质粒转染成功。

2.6 Western Blot 图5结果显示,基因敲除组(Lenticrispr-sgRNA2组和Lenticrispr-sgRNA3组)的MMP-2蛋白表达量明显降低，与空白对照组和转染空质粒组均有显著差异(P<0.05)。

图5 MMP-2蛋白表达量分析

3 讨论

经过试验发现，将Lenticrispr v2载体用Esp3I酶进行酶切时，在PCR仪中酶切效果不如在水浴锅中。在试验中酶切时间可适当延长，但不要超过Esp3I酶的有效作用时间(6 h)，若超过Esp3I酶的有效作用时间会把载体切碎，得不到所需片段。在对酶切好的载体进行切胶回收、纯化时，要用能够切胶回收的核酸染料(如溴化乙锭(EB))，在紫外线下不容易淬灭，以免造成切胶回收时载体浓度过低导致载体构建失败。本试验中酶切载体时对载体进行脱磷而Oligo则进行加磷处理之后再进行连接，这样可充分保证载体不会自连。其实Lenticrispr v2载体酶切后两端没有互补序列，所以不进行脱磷也不会自连，但并没有文献说明不脱磷对载体构建成功率是否有影响。

在转化过程中培养超过16 h就很容易出现卫星菌落和假阳性并且有提不出质粒的现象，这可能与带Amp抗性的细菌在生长时为了抵抗Amp会分泌一种能够降解Amp的β-内酰胺酶有巨大的关系。随着带Amp抗性细菌的生长，β-内酰胺酶分泌增多，培养基中的Amp逐渐减少，一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失，当Amp浓度降到很低不足以抑制杂菌生长时，未携带质粒的菌就会比带质粒的快，出现较多的假阳性。其次也有可能是构建好的载体拷贝数低，提取DNA量低，检测不出来。在试验中一开始平板中Amp浓度为50 μg/mL，有较多的假阳性和卫星菌落，后来Amp浓度增加为100 μg/mL，卫星菌落和假阳性明显减少。

转染时应选用活力旺盛的细胞，不要用含杂质较多的原代细胞，最好是第3～5代的细胞，可以大大增加转染效率。转染时小鼠成纤维细胞在六孔板中生长密度为80%～90%时使用脂质体转染方法，有研究表明,细胞转染效率主要受细胞状态、细胞生长密度、质粒浓度、脂质体以及转染时间有关[18]，经本试验筛选用3 μg载体与9 μL脂质体进行转染效果较好。小鼠和牛MMP-2基因的mRNA序列具有高同源性，本试验敲除小鼠成纤维细胞MMP-2基因，为以后在细胞层次研究MMP-2对炎症的影响提供基础。