鸡滑液囊支原体的流行调查及不同地区分离株药物敏感性分析

招丽婵，覃健萍，王占新，林 欣，孙石开，鲁俊鹏

(广东温氏食品集团股份有限公司，广东云浮527400)

鸡滑液囊支原体病是由鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)引起的一种传染病，又称鸡传染性滑膜炎(Avian onfectious synovitis)，其特征是关节肿大、滑液囊及肌腱发炎和实质器官的肿大，一旦在鸡群中感染很难根除[1]。该病能够感染鸡和火鸡，不同菌株的致病力有所不同，在鸡群中长期存在，会导致饲料利用率低、生长发育迟缓、种鸡生产性能下降[2]。感染发病鸡群抵抗力下降，易与其他病原体混合感染，加剧病情，增加死亡率，造成严重的经济损失。本病一年四季均可发生，但以冬春季节易发，各种日龄鸡只均易感， MS除了水平传播外，还可以发生垂直传播，通过感染鸡或火鸡经蛋传播给子代，感染初期经卵传播率较高[3]。该病先后在加拿大、英国、挪威、德国、法国、南非等国相继报道，世界性分布[4-5]，给养殖业带来较大的经济损失。防控鸡滑液囊支原体病主要通过疫苗免疫和药物控制两种方法[6-7]。我国养殖场主要靠抗菌药物预防及治疗该病，但随着药物的广泛使用，其防治效果欠佳，菌株耐药性加剧越来越明显。本研究主要对近年来鸡滑液囊支原体病的流行病学进行了调查分析，开展不同地区鸡滑液囊支原体临床菌株常规抗菌药物敏感性分析，为鸡滑液囊支原体病临床合理用药提供指导。

1 材料

1.1 鸡滑液囊支原体菌株及临床病料的采集 2015-2017年分别从广东、广西、江苏、浙江、福建等地方未免疫MS 活疫苗养殖场送检的157份疑似鸡滑液囊支原体感染的病鸡中，无菌采集其肿胀跗关节腔内容物用于临床流行菌株分离鉴定。MS-H株为澳大利亚生物资源公司鸡滑液囊支原体活疫苗株。

1.2 培养基改良Frey氏液体培养基，购自美国BD公司。

1.3 主要试剂 MS阳性血清(批号：200501)、MG阳性血清(批号：200701)和标准阴性血清(批号：20071217)，购自中国兽医药品监察所；Taq酶，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.4 抗菌药物 盐酸环丙沙星可溶性粉(批号：20170302)；盐酸多西环素可溶性粉(多西欣，批号：20170616)；盐酸沙拉沙星可溶性粉(沙拉欣，批号：20170805)；盐酸金霉素可溶性粉(批号20161217)；盐酸大观霉素盐酸林可霉素(利高欣，批号：20170703)；替米考星可溶性粉(替美康，批号：20170407)；酒石酸泰万菌素可溶性粉(爱乐新，批号：20170702)；酒石酸泰乐菌素可溶性粉(泰乐欣，批号：20170217)；硫酸庆大霉素可溶性粉(力速智，批号：20170407)，以上药物购自广东温氏大华农生物科技有限公司动物保健品厂；泰妙菌素(批号：B433719)，礼来(上海)动物保健有限公司。

2 方法

2.1 临床现场调查 2015年1月-2017年12月期间，本试验人员分别对广东、广西、江苏、浙江、福建等地10个不同地区养殖场的MS感染情况进行现场调查，系统开展了对各个养殖场不同品种鸡的感染情况(包括发病日龄、品种、发病季节等)及临床症状进行统计分析，并对部分发病鸡进行剖检观察。

2.2 病原学调查

2.2.1 病料来源 分别从广东、广西、江苏、浙江、福建等地10个不同地区未免疫MS活疫苗且有典型滑液囊支原体病症状的肉鸡养殖场，无菌采集肿胀跗关节、肿胀足掌部及龙骨滑液囊囊肿的发病鸡关节积液、黄色干酪样病变组织。

表1 2015-2017年病料来源信息

2.2.2 病原分离与鉴定 无菌采集肿胀跗关节、足掌内容物及龙骨滑液囊囊肿内容物，接种于改良Frey氏液体培养基，置37 ℃，150 r/min振荡培养。当改良Frey氏液体培养基的颜色由猩红变成橘黄时，传代接种到新的改良Frey氏液体培养基中，并取液体培养物涂片，进行姬姆萨染色，油镜下观察菌体形态，同时将液体培养物接种鸡滑液囊支原体固体培养基培养，置低倍镜下观察菌落形态。

2.2.3 分子生物学鉴定 取分离获得的疑似MS流行菌株，根据GenBank中收录的MSVlhA基因序列设计引物，进行PCR及序列测定以确诊发病鸡为MS感染。根据鸡滑液囊支原体VlhA基因设计合成引物，预期扩增片段大小为300 bp，上游引物 MSF：5′-TAAAAGCGGTTGTGTATCGC-3′,下游引物MSR:5′-CGCAGGTTTGCACGTCCTTCATCG-3′。

2.3 血清学试验 液体培养物37 ℃培养3代后，参照姜平[8]介绍的方法，离心浓缩进行平板凝集试验。

2.4 抗菌药物稀释 分别称取氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、林可胺类、四环素类及截短侧耳素类药物，溶于适宜稀释液中，无菌操作配制成浓度为各药物推荐使用浓度的8倍量进行敏感性试验，监测不同地区流行株对不同类型抗生素的药物敏感性。

2.5 不同地区临床分离株最低抑菌浓度(MIC)的测定 分别从广东、广西、江苏、浙江、福建等地10个不同地区分离鉴定的96个MS流行株中，随机选取10株生长优势流行株进行MIC测定，参照Hannan推荐的方法等并进行改进。根据不同分离株的颜色变化单位(CCU)决定接种菌液量为106CCU/mL。按照各药物推荐使用浓度的8倍量进行稀释，在96孔细胞微孔板中采用二倍稀释法进行最小抑菌浓度测定。判定标准为阴性对照孔不变色，阳性对照孔变为黄色，以试验孔不发生颜色变化(即没有MS生长)的最小抗生素浓度孔的稀释度为该药物对被试菌株的MIC。

3 结果

3.1 发病情况 调查结果表明，鸡群MS自然感染多见于l～4月龄，平均感染日龄为60日龄，而2017年早期20～40日龄其感染数量较2015年及2016年均有较大幅度下降。总体看来，40～80日龄时期是该病的防控关键期，在此期间需提前做好预防。来自不同地区的8个不同品种鸡(矮脚黄、清远麻、文昌鸡、黄油鸡、天露黑及817肉杂鸡)的平均感染率为8.89%，平均死亡率为2.79%，817肉杂鸡及清远麻鸡的感染死亡率占居首位。此外，不同地区的感染情况统计显示，广东新兴、广西南宁、江苏盐城的病死率较高，尤其以清远麻、矮脚黄及817肉杂鸡品种多发，且用药难以控制。2015-2017年不同月份感染情况调查表明，该病一年四季均有发生，南方地区一般在2～6月春夏交接梅雨季节期间及冬春季节多发易发。推测可能与该时期潮湿垫料容易滋生细菌，或南方地区高温高湿气候有关。期间多见与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌肠炎、球虫病等混合感染。

3.2 临床症状 对MS感染鸡只的临床症状统计表明：鸡群发病初期，采食量轻度减少，精神轻度不振，不易察觉。随着发病时间的延长，出现典型症状，采食明显减少，病鸡出现进行性消瘦，行走缓慢，闭眼呆立，拉绿色稀便，少数个别病鸡有甩鼻等呼吸道症状；跗关节和趾关节肿胀，肿胀处有波动感、热感；行走困难，足掌部及胸部龙骨处有囊肿或肿胀突出。发病后期，鸡体极度消瘦，呈现营养不良状态。

3.3 剖检病变 发病初期无明显病变；发病中期，病鸡的足掌部、跗关节肿胀部位剖开后有少量白色或淡黄色透明渗出性液体；随着病情发展，分泌物增多并变浑浊，呈灰白色脓性黏液或黄白色纤维素性干酪样物质，发病中后期个别发病鸡龙骨滑液囊部位也出现黄白色干酪样物质。

3.4 血清学试验 液体培养物37 ℃培养3代后离心浓缩，平板凝集试验结果显示，分离菌能够与MS标准阳性血清呈凝集反应，而与MG标准阳性血清不产生凝集反应。

3.5 病原学诊断结果

3.5.1 病原分离 采集157份来自不同地区具有典型滑液囊支原体临床症状病死鸡的跗关节、足掌及龙骨滑液囊囊肿病料进行细菌分离，对分离所得疑似菌株进行姬姆萨染色鉴定。通过多形态菌体形态和煎蛋样菌落初步诊断，分离到疑似MS流行菌株共计96株，分离率为61.15%。各地区MS分离株数及命名情况见表2。

表2 2015-2017年 5省份鸡群滑液囊支原体分离情况

3.5.2 分子生物学鉴定 将96株疑似MS分离流行菌株进行了VlhA基因PCR扩增，PCR结果表明：本试验分离获得的MS疑似流行株均能扩增出约300 bp的特异性片段，与引物设计的预期结果一致。进一步对鸡滑液囊支原体VlhA基因PCR扩增片段进行测序，并将测序结果与GenBank数据库中的MSVlhA序列比对，同源性为98.75%，确诊96株分离株均为MS菌株。

3.6 不同地区临床分离株最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用二倍稀释法测定了泰乐菌素等10种抗生素对鸡滑液囊支原体活疫苗株(MS-H)及鸡滑液囊支原体临床分离株的MIC测定(见表3)。结果显示，10株临床分离株均对截短侧耳素类泰妙菌素、大环内酯类泰万菌素、泰乐菌素及四环素类多西环素比较敏感；林可胺类盐酸大观霉素盐酸林可霉素、大环内酯类替米考星等敏感性次之；四环素类金霉素、氨基糖苷类庆大霉素敏感性显著下降；喹诺酮类盐酸环丙沙星、沙拉沙星敏感性较差。MS-H活疫苗株对截短侧耳素类泰妙菌素、大环内酯类泰万菌素、泰乐菌素、林可胺类盐酸大观霉素盐酸林可霉素、四环素类金霉素、多西环素、氨基糖苷类庆大霉素则均较为敏感。不同地区不同品种鸡只分离株对个别同种类抗生素敏感性差异较大，尤其表现在大环内酯类替米考星、林可胺类盐酸大观霉素盐酸林可霉素及四环素类金霉素，其中不同菌株对金霉素的敏感性在3.91 mg/L～1 000 mg/L不等。

表3 庆大霉素等10种抗生素对鸡滑液囊支原体的MIC值 (mg/L)

4 讨论

本研究对我国广东、广西、江苏、浙江、福建等5个省份10个不同地区的养殖场调查发现，MS感染多见于1～4月龄，40～80日龄是MS野毒自然感染的敏感高峰期，感染率为5.89%～14.23%不等，矮脚黄、清远麻、817肉杂鸡等8个不同品种鸡病死率差异较大，清远麻、天露黑及817肉杂鸡平均感染率为10.98%；平均死亡率为3.01%。矮脚黄、土鸡、文昌鸡等感染死亡率较低。可见，MS田间流行株对不同品种鸡的感染敏感性差异较大，或者与个别品种饲养过程中选育生长加快有一定关系。从不同地区的感染情况统计来看，广东新兴、江苏盐城、广西南宁等地区的感染率比较高。这可能与该地区的养殖密度大，鸡群健康度比较复杂有关。对2015-2017年不同月份鸡只感染情况调查的结果表明，该病一年四季均有发生，南方春夏潮湿天气、北方冬春季节易发，总体发病2015年最为严重，2016年及2017年逐年减少。

MS感染有水平传播和垂直传播两种方式，本研究通过对多个种鸡养殖场的追踪调查发现，部分小于20日龄的商品肉鸡发病，进一步追溯可能由于该批次种蛋的种鸡群当时已出现MS感染导致垂直传播而引起的。40～80日龄感染的鸡只，大多数是由于养殖场饲养环境，饲养管理欠佳，通过水平传播方式感染发病，此时MS流行株非常容易通过呼吸道感染进入鸡只体内，侵入鸡跗关节和足掌部关节等，致使受侵害关节肿胀发炎，从而导致临床上明显的关节炎症状。主要表现为青年鸡趾关节肿胀、足掌部、跗关节肿胀、龙骨滑液囊囊肿，种鸡的生产性能下降，料肉比增加，种蛋多见“太阳蛋”，入孵率下降等症状。

2015-2017年分别从10个不同地区的养殖场157份疑似支原体感染病例进行病原菌的分离鉴定，形态病原学结合PCR扩增测序确认分离获得鸡滑液囊支原体流行株共计96株。虽然支原体的分离鉴定工作难度较大，耗时较长，但结果可靠准确，且能进一步进行药敏试验，对临床用药具有一定的指导意义。

从不同地区临床分离株最低抑菌浓度测定结果看，庆大菌素等10种抗生素中，鸡滑液囊支原体弱毒活疫苗株对大环内酯类泰乐菌素、泰万菌素、替米考星、喹诺酮类环丙沙星、林可胺类盐酸大观林可霉素、四环素类金霉素及截短侧耳素类泰妙菌素均高度敏感，因此在使用MS活疫苗进行鸡滑液囊支原体防控期间需注意敏感药物的停止使用。

10株鸡滑液囊支原体临床分离菌株对大环内酯类泰万菌素、截短侧耳素类泰妙菌素的MIC值分别为0.15 mg/L和0.24～0.96mg/L，不同地区分离株间测定的MIC值差异不大，说明泰万菌素、泰妙菌素仍能保持较好的敏感性，该结果与Landman[7]等体外研究发现17种MS荷兰本地分离株均对泰万菌素、泰妙菌素敏感的结果一致，分析可能是因为泰万菌素和泰妙菌素价格较贵，成本高，临床使用不多，因此没有造成鸡滑液囊支原体对其产生耐药性。宋战胜[3]、曹中赞[10]等认为不同菌株对药物的敏感性存在差异，本研究中广东新兴株和广西玉林株对大环内酯类替米考星的最低抑菌浓度分别为750 mg/L和375 mg/L，而活疫苗MS-H株及其中3株鸡滑液囊支原体临床分离株的最低抑菌浓度则为5.86 mg/L，因此本试验也证实了这一观点。另外，值得关注的是江苏盐城株对四环素类金霉素的最低抑菌浓度为1 000 mg/L，与活疫苗MS-H株及临床分离的广东新兴株相比其敏感性分别降低了256倍和128倍，可见在种肉鸡饲养过程中长期的药物防控和选育压力下，个别地区已经出现了超级耐药菌株。因此，在实际临床生产中应定期对不同地区流行株进行药敏试验，选用有效的抗菌药物，避免盲目的长期使用单一种类抗生素进行预防及治疗，以减少菌株耐药性的产生和扩散。