伤科黄药微生物限度检查法的适用性考察分析

张荔

祖国医学是我国医疗体系不可或缺的重要组成部分，中医中药在疾病的预防与控制中发挥了重要作用。许多医院自制药均为中药制剂，临床应用非常广泛。本研究中的伤科黄药为我院自制，具有显著的杀虫利湿、清热解毒的功效[1]。根据国家规定，医院自制药剂均应符合规定的制剂标准，2015 年版中国药典规定，应对伤科黄药的微生物检查方法进行适用性考察，鉴于以上认识，笔者进行了本研究以寻找正确的微生物检查法[2]。本研究就采用了3 种方法对伤科黄药进行控制菌和微生物计数验证，结果显示3 种方法均符合新版药典要求，且稳定可行，可用于伤科黄药的微生物限度检查。

1 资料与方法

1.1 仪器

本研究是选取2017 年1 月—2018 年12 月期间，在湖北省襄阳市中医医院药学部进行研究的伤科黄药。KSF220 集菌培养器、HTY-2000B 集菌仪、LAS-9203A 热空气消毒箱、LBI-250 生化培养箱、PL602-L 电子天平、HH-4 数显恒温水浴锅、DW-86L288型-80℃立式超低温保存箱、SW-CJ-2FD 洁净工作台、LMQC 立式灭菌器、QYYS-20A 超纯水机。

1.2 试药

伤科黄药：医院自制，500 mL×400 瓶，药方为黄连须等。氧化酶试剂、兔血浆、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液[3]。

1.3 菌种

黑曲霉、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。

1.4 试验菌制备

室温放置黑曲霉菌悬液，制备沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面培养基，用无菌吸管吸取2 滴菌悬液滴在沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上，25℃培养5 d，然后用3～5 mL 蛋白胨缓冲液洗脱孢子，将孢子菌悬液接种到沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面复壮，25℃培养5 d，再使用3 mL～5 mL 蛋白胨缓冲液洗脱孢子。将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别转到8～10 mL 35℃胰酪大豆胨液体培养基中复苏1 d。将白色念珠菌转移到8～10 mL 25℃沙氏葡萄糖液体培养基中复苏2 d，然后转移到10 mL 25℃沙氏葡萄糖液体培养基复壮1 d。用0.9%氯化钠溶液稀释上述各菌悬液，用平皿法行活菌点计，选择含菌量50～100 cfu/mL 的稀释菌液当作试验菌[4]。

1.5 微生物计数检查法验证试验

采用黑曲霉、白色念珠菌进行酵母菌和霉菌总数计数检查法验证，采用沙氏葡萄糖琼脂培养基，25℃培养5 d。采用黑曲霉、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌进行需氧菌总数计数检查法验证，供试品组和含黑曲霉、念珠菌的平皿倾倒胰酪大豆胨琼脂培养基，25℃培养5 d，含铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的平皿倾倒胰酪大豆胨琼脂培养基，35℃培养3 d[5]。

1.5.1 常规法 酒精棉球消毒处理科洗剂供试品（20180710），pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1:10 供试液。稀释剂组：取10 mL pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液置入平皿中，制备两个平皿倾倒对应的培养基。菌液组：取9.9 mL pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入0.1 mL 各试验菌，含菌量50～100 cfu/mL，取1 mL 置平皿中，各试验菌制备2 个平皿，倾倒对应的培养基。供试品组：取10 mL 供试液置平皿中制备两2 个平皿。试验组：取9.9 mL 供试液加入0.1 mL 各试验菌，含菌量50～100 cfu/mL，取1 mL 置平皿中，各试验菌制备2 个平皿，倾倒对应的培养基。

1.5.2 供试液稀释法 酒精棉球消毒处理科洗剂供试品（20180710），pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1:10供试液，剩余操作同“常规法”[6]。

1.5.3 薄膜过滤法 菌液组：用100 mL pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗 3 次，最后一次时加入各试验菌，含菌量50～100 cfu/mL，将集菌培养器打开，取膜，再将滤膜菌贴于对应的平板培养基上。供试品组：取10 mL 供试液加入KSF 220 集菌培养器，100 mL pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3 次，将集菌培养器打开，取膜，再将滤膜菌贴于对应的平板培养基上[7]。试验组：取10 mL 供试液加入KSF 220 集菌培养器，100 mL pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3 次，最后一次时加入各试验菌，含菌量50～100 cfu/mL，将集菌培养器打开，取膜，再将滤膜菌贴于对应的平板培养基上[8]。

2 结果

2.1 控制菌检查验证

2.1.1 铜绿假单胞菌检查验证 试验组：取1 mL 铜绿假单胞菌菌液和10 mL 1:10 供试液接种到200 mL 胰酪大豆胨液体培养基35℃培养18 h，取培养物接种到溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基35℃培养18 h。阴性对照组：将10 mL 稀释剂加入200 mL 胰酪大豆胨液体培养基，操作同试验组。

2.1.2 金黄色葡萄球菌检查验证 试验组：1 mL 金黄色葡萄球菌菌液和10 mL 1:10 供试液接种到200 mL 胰酪大豆胨液体培养基35℃培养18 h，取培养物接种到甘露醇氯化钠琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基。阴性对照组：将10 mL 稀释剂加入200 mL 胰酪大豆胨液体培养基，操作同试验组[9-10]。

2.1.3 控制菌检查验证结果 铜绿假单胞菌的验证试验中，试验组和阳性对照组检测均有菌落生长，阴性对照组没有菌落生长；金黄色葡萄球菌的验证试验中，试验组和阳性对照组检测均有菌落生长，阴性对照组没有菌落生长，见表1[11-12]。

表1 控制菌检查验证结果

2.2 批伤科黄药的微生物限度检查结果

通过上述微生物限度检查法验证检查3 批伤科黄药，结果均符合药典规定，见表2。

表2 3 批伤科黄药的微生物限度检查结果

3 讨论

结果“2.2”显示，本院自制伤科黄药可用于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的微生物限度检查，说明伤科黄药微生物限度检查法经验证符合2015 年版中国药典要求。