彝族“黄药”艾纳香中黄酮的提取工艺优选研究

中央民族大学药学院，北京 100081

彝族“黄药”的中药名为艾纳香，又称为大风艾、牛耳艾、大骨风、冰片艾等，为菊科艾纳香属植物艾纳香(BLumeabaLsamiferaDC.)全草[1]，主要分布在云南、贵州、广西、广东等地[2]。艾纳香最早记载于公元741年陈藏器所编著的《本草拾遗》：“主癣避蛇”，由于疗效确切，在历代本草等相关文献中均有关于艾纳香用途、用法及疗效等方面的记载[3]。艾纳香以其全草或地上部分入药，其性味苦、温、辛，主要有祛风除湿、活血调经、消肿止痛等功效[4]。彝医认为其性味苦，入脾、肺气路，有清热解毒、逐瘀化痰的功效，在中国西南彝族地区被广泛应用于抗肿瘤，尤以抗肺癌效果为佳[5]。

文献报道，艾纳香的主要成分为黄酮和挥发油，同时也含有少量的苷类成分，其中黄酮类成分的研究最为广泛。目前报道的黄酮类物质主要为黄酮(醇)类、二氢黄酮类和查尔酮类三大类[6-10]。其药理作用也主要集中在黄酮类物质的作用上，具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎以及保肝等活性[11-13]。为合理利用彝族“黄药”艾纳香植物中的黄酮类化合物，需要优化对其进行最大化提取分离的方法。目前已有学者对“黄药”艾纳香的总黄酮提取工艺和含量测定进行了考察，黄永林等[14]采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品，对艾纳香叶、小枝条、茎中总黄酮含量进行了测定，结果显示叶中总黄酮含量最高为2.94%，小枝条含量最低只有1.21%。罗夫来等[15]用紫外分光光度法测定总黄酮含量，以提取率为指标，用正交实验方法优选艾纳香最佳提取工艺。和银霞等[16]用超声波提取方法考察了艾纳香的提取工艺，并测定不同部位总黄酮的含量。课题组前期研究结果[17]表明，艾纳香的黄酮成分主要富集在二氯甲烷和乙酸乙酯萃取部位。本研究在罗夫来等[15]研究基础上考察了提取次数对总黄酮提取率的影响，并利用正交设计实验选取乙酸乙酯萃取部位对彝族“黄药”艾纳香中总黄酮进行考察，以期找到最佳的提取工艺，为更好地开发利用艾纳香并发挥其药用价值提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AdventurerOHAUS电子天平，UV1700PC紫外可见分光光度计(上海凤凰光学仪器有限公司)。

1.2 药材 “黄药”为菊科艾纳香属植物艾纳香的干燥茎、叶，购自河北安国药材市场，经DNA条形码鉴定为真品。

1.3 试剂 芦丁对照品(北京百灵威科技有限公司)。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯。

2 方法

2.1 艾纳香中总黄酮测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品15.1 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得到0.151 mg/mL对照品溶液。

2.1.2 标准曲线绘制精密 吸取芦丁对照品溶液0、1、2、4、6、8 mL，分别置于25 mL的容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min；10% AL(NO3)3溶液1 mL，摇匀，放置6 min；4% NaOH溶液10 mL，摇匀，静置15 min，加水至相应刻度。在510 nm处测定各溶液的吸光度。以质量浓度对吸光度进行线性回归，得回归方程A=11.278C+0.0275，R2=0.9992。表明芦丁在0.00604～0.04832 mg/mL与吸光度线性关系良好。标准曲线如图1。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取艾纳香药材2.0 g，根据正交试验设计用不同体积分数的乙醇按不同的料液比、不同的加热时间以及不同加热次数进行回流提取，滤过，收集滤液，减压浓缩成浸膏。将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉。精密称取萃取物干粉25.0 mg置于25 mL容量瓶中，充分溶解后，做供试品溶液(浓度为1 mg/mL)待用。

2.1.4 精密度试验 称取艾纳香药材2.0 g，用80%的乙醇按料液比为15∶1加热回流3次，每次3 h，收集滤液，减压浓缩成浸膏。将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉。精密称取萃取物干粉25.0 mg置于25 mL容量瓶中，充分溶解后，做供试品溶液待用。精密量取2 mL供试品置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”项下处理，测定吸光度，连续测定5次，计算吸光度RSD值为0.515%，表明仪器的精密度良好。

2.1.5 重复性试验 称取同一批艾纳香药材5份，按“2.1.4”项下制备供试品溶液，精密量取2 mL供试品置于25 mL容量瓶中，其余的步骤按“2.1.2”项下方法进行显色处理，测定吸光度值，结果吸光度值得RSD值为1.035%。

2.1.6 稳定性试验 精密量取2 mL供试品置于25 mL容量瓶中，其余步骤按“2.1.2”项下方法加显色剂显色进行处理，分别在0、5、10、15、20、25、30 min测定其吸光度值，计算RSD值为0.5627%，样品在30 min内稳定性较好。

2.1.7 加样回收率试验 称取同一批艾纳香药材1.0 g，按“2.1.4”项下制备供试品溶液，精密量取5份2 mL供试品溶液置于25 mL容量瓶中，分别加入0.151 mg/mL的芦丁对照品2 mL，其余的步骤按“2.1.2”项下方法进行显色处理，测定吸光度值，结果平均回收率为97.3%，RSD值为0.753%。

2.1.8 总黄酮的测定 取艾纳香药材按“2.1.3”制备供试品溶液，按“2.1.2”项下方法进行显色处理，测定吸光度值，代入回归方程，计算总黄酮的含量。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 对乙醇浓度设5个浓度梯度即40%、50%、60%、70%、80%。精密称取艾纳香全草2.0 g，置于100 mL三角瓶中，加相应浓度乙醇 40 mL，70 ℃水浴回流提取3次，每次 2 h，提取液过滤，合并浓缩得浸膏，将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉，精密称取萃取物干粉25 mg置于25 mL容量瓶中，按“标准曲线的制备”项下方法显色后，测吸光度，根据“2.1.2标准曲线”回归方程计算总黄酮含量和提取率。

由图2可知，当乙醇浓度小于 50% 时，随着乙醇浓度的增大，总黄酮提取率程增加趋势; 当乙醇浓度为 50% 时，总黄酮提取率最高; 此后，再增加乙醇浓度，总黄酮提取率反而下降，因此，确定乙醇浓度为 50% 左右较为合适。

2.2.2 提取时间对总黄酮提取率的影响 考察提取时间的影响，设置5个时间梯度，即0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h。精密称取2.0 g艾纳香全草，置于100 mL 三角瓶中，加50 %乙醇 40 mL，70 ℃ 水浴回流至规定时间，提取液过滤，共提取3次，合并浓缩得浸膏，将浸膏用蒸馏水超声混悬，在碱性条件下用石油醚萃取，弃去石油醚部位，将水部位酸化后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后冻干得到萃取物干粉，精密称取萃取物干粉25 mg置于25 mL容量瓶中，按“标准曲线的制备”项下方法显色后，测吸光度，根据“2.1.2标准曲线”回归方程计算总黄酮含量和提取率。

由图3可知，当提取时间小于1.5 h时，随着提取时间的延长，总黄酮提取率程增加趋势；当提取时间为1.5 h左右时，总黄酮提取率最高；此后，再延长提取时间，总黄酮提取率反而略微下降。因此，确定提取时间为1.5 h左右较为合适。

2.3 因素水平的选择 根据预实验以及相关文献研究选取影响艾纳香回流提取的乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取次数(C)和提取时间(D)为考察因素，选用L9(34)正交试验表筛选最佳工艺。见表1。

表1 因素与水平

2.4 正交试验 取艾纳香药材2 g，按照设计的实验方案进行提取，滤过，减压浓缩得浸膏，浸膏水溶液依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，浓缩冻干成干粉。称取相应质量的萃取物粉末，配置成供试品溶液，测定其吸光度值，根据芦丁标准曲线方程计算艾纳香总黄酮百分含量。以该结果列入正交设计表中进行统计。

总黄酮提取率(%)=总黄酮的含量/药材的重量

表2 正交实验设计和结果

由表2、3可知，各因素对提取率的影响依次为B>C>D>A，即料液比>提取次数>提取时间>乙醇浓度。由此得到最佳提取工艺为A1B3C2D2，即乙醇的浓度为50%，加入16倍量的乙醇，提取时间为1.5 h，提取次数3次。

表 3 方差分析结果

F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

2.5 验证试验 称取3份艾纳香药材各2 g，按照上述优选的最佳工艺进行提取，萃取得到萃取物干粉，照上述建立的测定方法条件测定，计算艾纳香药材中总黄酮提取率。结果艾纳香药材中总黄酮的提取率分别为2.74%、2.81%、2.77%，平均值为2.77%，RSD值为1.27%。结果表明所选工艺合理、稳定、可行。

3 讨论

测定黄酮含量目前最常用的方法是紫外-可见光分光光度法(比色法)，是被测物质在适当的显色剂显色后，在特定波长处或一定波长范围内的测定吸光度或发光强度，从而对该物质进行定性和定量分析的方法[18]。总黄酮含量的测定往往采用芦丁作对照品，经亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色后，在510 nm处测定吸光度值[14]。

实验选择对总黄酮提取率影响量较大的乙醇浓度、料液比、提取时间以及提取次数为4个主要因数，采用正交实验法优化艾纳香的总黄酮提取工艺。实验结果可知，提取次数对艾纳香中总黄酮的提取影响最大，其次为乙醇浓度、提取时间和料液比。最终优选的工艺条件为采用16倍量的50%的乙醇提取3次，每次提取1.5 h。该工艺验证，3次提取结果的总黄酮提取率RSD值为2.0%，说明该工艺重复性良好，且总黄酮提取量最大，因此确定为最佳提取条件，为后续的艾纳香研究实验作为参考。随着临床研究的进一步发展，艾纳香中总黄酮的药理作用及作用机制将进一步被阐释说明，本实验得出的最佳提取工艺将对彝族“黄药”艾纳香的深度开发利用提供了可靠的实验依据。