T-SPOT.TB在肺结核早期抗痨治疗有效过程中的变化趋势研究

李晓非，刘红伟，罗风，邱万

中国为结核病高流行国家［1］，2017年全球新发结核病患者约1 000万例，我国新发结核病患者88.9万，结核病疫情严峻［2-3］。控制肺结核的关键是探索出精准有效的结核病诊断及治疗监测新方法［4-5］。但是当前临床上尚无针对抗痨治疗效果快速准确的评估手段，仅仅通过观察患者的临床表现及辅助检查结果来推断治疗是否有效，特异度及敏感度均较低［6-7］。因此，探索可快速、特异、正确地反映肺结核抗痨疗效的方法已迫在眉睫。结核感染T细胞斑点试验（T-cell spot of Tuberculosis，T-SPOT.TB）是根据酶联免疫斑点法（enzyme-linked immunospot test，ELISPOT）的原理直接检测并计数人新鲜外周血中释放γ-干扰素的结核特异性抗原［早期分泌靶向抗原 6（earlysecreting antigen target-6，ESAT-6）、培养滤液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）］刺激活化效应T细胞数量的方法，在结核病诊断方面有较高的价值［8-10］。有研究显示，随着抗痨治疗进行，机体结核分枝杆菌数量降低，患者细胞免疫（抗原特异性免疫）应答状态随之改变，继而可能出现结核特异性活化效应T细胞数量的不断减少，即TSPOT.TB结果的降低，提示T-SPOT.TB有望成为监测肺结核患者早期抗痨治疗效果的指标［7，11-13］。目前，国内偶有关于T-SPOT.TB监测肺结核治疗效果的报道，且各家研究结果并不完全一致［6-7，14］。基于以上问题，本研究通过分析肺结核患者抗痨治疗前后T-SPOT.TB结果动态变化趋势及机体对结核特异性抗原（ESAT-6、CFP-10）刺激免疫应答水平的变化，探讨T-SPOT.TB在肺结核早期抗痨治疗有效过程中的变化趋势，以期为临床肺结核抗痨疗效评估，探索出切实有效的实验室监测指标。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2016年6月—2019年2月在我院结核科明确诊断为初治活动性肺结核患者。纳入标准：（1）符合中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断（WS 288-2017）［15］。（2）依据《结核病治疗指南》进行规范化抗结核治疗［16-17］。（3）初诊及随访均在我院做T-SPOT.TB检测。（4）经规范化抗痨治疗，依据临床表现及辅助检查判断为治疗有效者。排除标准：（1）来我院就诊前已经接受过抗结核治疗。（2）随访未成功。（3）患有艾滋病、病毒性肝炎、肿瘤等其他疾病导致机体免疫系统受影响者。依据以上标准，最终纳入研究对象50例，男、女各25例，年龄17～65岁，中位年龄27岁。本研究获昆明市第三人民医院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。

1.2主要材料 T-SPOT.TB试剂盒、温控水平离心机（18～25℃，离心力≥1 800×g）。RPMI-1640培养基（江苏长星公司）、缓冲液（天津灏洋华科公司）、人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋华科公司）、显微镜（奥林巴斯CX-31）、生物安全柜（青岛海尔公司）。

1.3试验方法

1.3.1标本采集 收集患者抗结核治疗前、治疗后（30 d、1个月、3个月）血液标本，同时对患者历次就诊时的临床表现做好详细记录。用无菌注射器抽取外周静脉血5～8 mL至加有肝素钠的真空采血管中，室温（18～25℃）保存，4 h内完成外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分离。

1.3.2T-SPOT.TB操作及结果判读 试验操作过程及结果判读均按照T-SPOT.TB试剂盒配套说明书严格执行。准确记录每1个检测样本T-SPOT.TB试验结果中ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔的具体斑点数值。根据抗原ESAT-6和/或抗原CFP-10孔的反应判断结果，阳性结果参照以下两条标准中的任意一条：（1）空白对照孔斑点数为0～5个时：（抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6。（2）空白对照孔斑点数为6～10个时：（抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）。

1.4疗效观察 患者抗结核治疗采取自行服药方式，遵医嘱门诊定期复查。临床表现（如咯血、消瘦、胸痛、发热等）持续缓解及辅助检查提示病灶消失或钙化等为有效病例，纳入本次研究［18］；若抗痨治疗后临床表现及辅助检查结果无明显变化或病情加重，则视为无效病例［19］，予以剔除。

1.5质量控制 课题数据采集前，对相关专业人员分别参照《肺结核诊断标准》（WS 288-2017）、《结核病治疗指南》和TSPOT.TB（免疫斑点法）操作说明书等，统一进行规范化培训。严格按照纳入及排除标准收集数据，信息调查留取纸质版，采用双人双录方式录入检测数据，请专业技术人员进行TSPOT.TB试验操作且整个操作过程均达到质量控制目标。注：《肺结核诊断标准》（WS 288-2017）未实施之前，本研究入组病例诊断标准参照《肺结核诊断标准》（WS 288-2008）。

1.6统计学方法 采用SPSS 20.0进行数据分析处理。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，不同时间点比较采用Friedman秩和检验；计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1肺结核患者抗痨治疗有效过程中T-SPOT.TB斑点数变化趋势 T-SPOT.TB斑点数（ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔、“ESAT-6+CFP-10”抗原孔）在初诊行短程标准抗结核治疗前和治疗后30 d、1个月、3个月基本呈逐渐降低的趋势（P＜0.05），见图1、表1。

Fig.1 Trends of T-SPOT.TB results before and after treatment at 0.5,1 and 3 months图1 治疗前和治疗后0.5、1、3个月T-SPOT.TB结果变化趋势

2.2治疗前及治疗3个月后机体对ESAT-6、CFP-10刺激应答变化趋势 与治疗前相比，机体在治疗3个月后对ESAT-6和CFP-10抗原刺激应答反应均下降。ESAT-6应答变化升高占比14.00%（7/50）、降低占比86.00%（43/50）；CFP-10应答变化升高占比4.00%（2/50）、降低占比96.00%（48/50），治疗3个月后机体对ESAT-6、CFP-10应答反应变化一致（χ2=1.954，P=0.162）。

Tab.1 Comparison of T-SPOT.TB results between different time points表1 不同时间点T-SPOT.TB结果的差异性比较 ［M（P25，P75）］

3 讨论

T-SPOT.TB是利用当机体T淋巴细胞再次受到具有毒力的结核分枝杆菌特异性抗原刺激后可活化为分泌结核分枝杆菌特异性γ-干扰素的效应T细胞，检测并计数效应T细胞数量，以评估机体是否被结核分枝杆菌感染的一种手段；该试验中的抗原在致病结核分枝杆菌RD1区上：Rv3874编码的CFP-10抗原和Rv3875编码的ESAT-6抗原［20-23］。有研究显示，结核分枝杆菌抗原特异性效应T细胞一旦失去致病菌的刺激就会很快凋亡，且结核病患者若不进行任何临床干预，其T-SPOT.TB结果不变；但随着抗痨治疗的有效进行，机体结核分枝杆菌抗原特异性细胞免疫应答水平随之改变，效应T细胞数量会随着机体内细菌载量的下降而下降［24-25］；说明TSPOT.TB结果可能会随着患者抗痨治疗病情好转而不断降低甚至转阴，从而进一步提示T-SPOT.TB可能成为评估活动性肺结核抗痨治疗效果的一个新的敏感指标［26-29］。

本次初步研究发现T-SPOT.TB斑点数在肺结核早期抗痨治疗有效过程中呈下降趋势。吴家宝等［12］对9例活动性肺结核患者也进行了4个时间点（治疗前，治疗后2、4、6个月）的追踪观察，结果发现随着抗痨治疗地有效进行，结核分枝杆菌抗原特异性淋巴细胞的数量随着机体致病菌负荷的下降而变化。Park等［30］观察并记录确诊的33例活动性肺结核患者抗痨治疗前及治疗结束时的数据，分析结果发现ESAT-6和CFP-10的平均斑点计数分别下降了27和24，指出随着抗痨治疗地有效进行，T-SPOT.TB结果明显下降。以上研究结果均与本研究结果相似。Wang等［29］对13例正在抗痨治疗的肺外结核患者进行了连续T-SPOT.TB检测，发现在抗痨治疗6个月后，ESAT-6和CFP-10抗原孔斑点数无明显下降（P=0.191，P=0.061）。汪锴等［24］对62例脊柱结核患者进行了5个时间点（抗痨治疗前、1、3、6和12个月）的追踪随访，结果发现在后4个时间点统计TSPOT.TB结果转阴人数/临床症状缓解人数比值分别为0、8.3%、22.0%和51.3%，提示该试验不可用于评估脊柱结核疗效。以上研究结果与本研究结果不一致，考虑原因可能为：（1）入组样本量均较少。（2）研究追踪随访时间不同。（3）研究结核感染部位及病种差异。（4）研究人群的地域及遗传背景差异。（5）采用T-SPOT.TB判断疾病预后的视角不同等。

本研究还发现，经过3个月治疗，机体对ESAT-6、CFP-10刺激应答水平变化一致。何紫琪等［6］对113例结核病患者治疗前、后CFP-10和ESAT-6应答变化趋势分析发现，治疗前、后机体对CFP-10和ESAT-6抗原应答变化有差异，结核病治疗的有效监测手段是CFP-10的定量应答，与本研究结果存在差异。Ewer等［31］对38例结核菌素皮肤试验阳性者进行研究发现，其接受3个月预防性抗痨治疗后，RD1区特异性T细胞反应显著下降，其中16%的患者在随访期间出现RD1区特异性T细胞反应呈阴性，该现象可能反映了预防性抗痨治疗期间活杆菌数量的减少，此研究与本研究结果基本相符。Aiken等［32］研究发现，抗痨治疗1年后，机体对CFP-10和ESAT-6刺激的应答反应降低，伴随着结核病的成功治疗，结核分枝杆菌特异性抗原斑点计数显著下降，提示ELISPOT试验具有成为衡量结核病治疗效果的潜力。目前关于肺结核患者抗痨治疗过程中机体对ESAT-6、CFP-10刺激应答水平变化的研究略少，考虑到此研究现状，分析各研究结果差异的原因可能是：（1）不同学者对研究对象的追踪观察时间点各不相同。（2）不同患者由于遗传背景不同，个体存在较大差异。（3）不同科研团队检测技术水平差异。（4）样本量差异导致结果偏移。（5）研究对象的入组标准、病种及分组差异等。

目前T-SPOT.TB试验已在世界各地许多实验室得到广泛应用，关于探索T-SPOT.TB是否能成为肺结核疗效监测有效指标方面仍存在争议，不同研究从不同的视角出发，探索出其监测结核病疗效的结论也存在较大差异。本研究从探索T-SPOT.TB斑点计数在肺结核早期抗痨治疗有效过程中的变化趋势这一视角出发，得出T-SPOT.TB斑点数在肺结核早期抗痨治疗有效过程中呈下降趋势；治疗前与抗痨治疗有效后（第3个月时）机体对ESAT-6、CFP-10刺激应答水平变化一致的结论。本研究为探索TSPOT.TB是否能成为肺结核抗痨疗效监测的良好指标进行了初步尝试。但由于本研究的标本量较少、追踪观察时间略短、入组人群缺少治疗失败或治疗期间病情反复的患者等不足，可能会使研究结果产生偏倚，未来仍需更全面、大样本（尤其是抗痨治疗无效结核病患者）、多中心的前瞻性病例对照研究，为探索T-SPOT.TB是否能成为肺结核疗效监测的良好指标提供更全面的数据支持。