白细胞介素-4负调控NF-κB通路抑制炎症反应的机制研究

黄洁媛，刘文明

既往研究证实，炎症反应继发的免疫失衡是重症感染病理生理过程的重要特点，也是重症感染患者病情加重的重要原因［1］。肺部严重感染时极易诱发急性肺损伤，这与机体免疫防御机制过度激活、促炎/抑炎反应失衡和氧化应激损伤有关［2］。因此在抗感染的基础上，恢复促炎/抑炎反应平衡，阻断炎症级联反应是急性肺损伤早期治疗的关键。白细胞介素（interleukin，IL）-4是重要的抑炎细胞因子，由CD4+T细胞分泌，对淋巴细胞的迁移具有重要作用。既往已有研究证明，IL-4可以下调炎症反应强度，降低严重感染小鼠的死亡率［3］，但是其抑炎机制目前尚未明了。髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是Toll样受体信号通路中的重要接头分子，可以与核因子（NF）-κB形成炎症反应通路，导致NF-κB p65蛋白从细胞质转入细胞核，从而诱导 IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎细胞因子的转录和表达，放大炎症信号。MyD88/NF-κB信号通路在感染性疾病的发生和发展中占有重要地位［4-5］。已有研究证明，IL-4可以抑制IκB激酶（IKK）的活性，进而抑制NF-κB活化。另外，IL-4对NF-κB的作用不仅局限于下游水平，对上游也会造成影响［6-7］。因此笔者推测，IL-4可能作用于MyD88/NF-κB信号通路，进而影响NF-κB活性及p65蛋白的核移位以下调炎症反应。本研究以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）启动小鼠巨噬细胞株Ana-1的炎症反应，分析IL-4预处理对LPS诱导的巨噬细胞MyD88/NF-κB信号通路的影响，探讨IL-4抑制炎症的可能机制。

1 材料与方法

1.1主要材料和仪器 小鼠巨噬细胞Ana-1购自上海信裕生物科技有限公司（货号XY-M001）；小鼠IL-4购自上海恒斐生物科技有限公司（货号130-097-760）；DMEM培养基购自杭州仟诺生物科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；兔抗鼠MyD88和NF-κB p65单克隆抗体购自上海生物工程有限公司；羊抗兔生物素化IgG购自北京中杉金桥公司；小鼠TNF-α和IL-6酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒购自上海哈灵生物科技公司；小鼠NF-κB p65 ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技公司；胞浆和胞核蛋白提取试剂盒购于武汉博士德有限公司。ABI 7500实时荧光定量PCR仪（ABI），半干转印仪（Bio-Rad），垂直电泳仪（Bio-Rad），HBS-1096A酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养和构建LPS±IL-4处理Ana-1细胞模型 Ana-1巨噬细胞采用DMEM培养基培养，内含10%灭活胎牛血清、100 U/mL链霉素和100 mg/L青霉素，37℃，5%CO2常规细胞培养，隔日换液。当细胞贴壁融合度达到90%以上时，用0.25%胰蛋白酶进行传代。传代细胞接种于6孔板（1×106个/孔）。取对数生长期的Ana-1巨噬细胞，将6孔板中的Ana-1细胞分为2组：分别为LPS组（给予50µg/L LPS刺激）、LPS+IL-4组（10µg/L IL-4预培养1 h后给予LPS刺激）。在0、0.5、1和2 h时收集细胞培养上清液，用于后续实验。

1.2.2RT-PCR检测MyD88、NF-κB mRNA表达水平 TRIzol法提取Ana-1巨噬细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明将其逆转录为cDNA。以β-actin为内参，通过ABI 7500实时荧光定量PCR仪分别进行荧光定量PCR反应。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成并提供，序列见表1。RT-PCR反应条件为：预变性95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共计40个循环。每个样本至少重复3次。2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

Tab.1 The primer sequence of MyD88,NF-κB and actin表1 RT-PCR引物序列

1.2.3Western blot检测MyD88和NF-κB蛋白表达水平 按照试剂盒说明书分别提取总蛋白、胞浆蛋白和胞核蛋白，BCA法进行蛋白定量。取20µL样品加入5×SDS缓冲液，煮沸5 min使蛋白变性。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗（兔抗鼠MyD88或NF-κB p65单克隆抗体，1∶1 000），4 ℃过夜，弃去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室温孵育二抗（羊抗兔生物素化IgG，1∶1 000）2 h，弃去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL显色，同期以β-actin作内参。显影后通过Quantity One软件分析各条带，以各条带与内参吸光度的比值表示MyD88/NF-κB p65的相对表达量。

1.2.4ELISA检测NF-κB p65胞核/胞浆比例 按照试剂盒说明书分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白，BCA法进行蛋白定量。按照NF-κB p65 ELISA检测试剂盒说明书分别检测NF-κB p65在细胞核及细胞浆中的含量，检测时波长设置为450 nm，并计算NF-κB p65胞核/胞浆比例。

1.2.5ELISA检测IL-6和TNF-α含量 收集各组细胞的培养液，3 000 r/min离心10 min，取上清液，按照TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒说明书进行IL-6和TNF-α含量的检测，检测波长设置为450 nm。

1.3统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，2组不同时间点间比较采用重复测量设计的方差分析，同一时间点组间比较行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1IL-4对LPS活化的Ana-1细胞表达MyD88的影响 随着Ana-1细胞培养时间的延长，LPS组MyD88 mRNA和蛋白表达水平均呈逐渐升高趋势（P＜0.05）。而LPS+IL-4组MyD88 mRNA表达水平无明显变化（P＞0.05），MyD88蛋白表达水平则呈先升高后下降趋势（在0.5 h时最高，2 h时下降至最低）。LPS+IL-4组MyD88 mRNA和蛋白表达水平在0 h和0.5 h时与LPS组差异无统计学意义（P＞0.05），在1 h和2 h时显著低于LPS组（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 IL-4对LPS活化的Ana-1细胞表达MyD88蛋白的影响

2.2IL-4对LPS活化的Ana-1细胞NF-κB表达的影响 随着Ana-1细胞培养时间的延长，无论是LPS组还是LPS+IL-4组，NF-κB mRNA和蛋白表达水平均呈现明显升高趋势（P＜0.05）。而2组不同时间点NF-κB mRNA和蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表3。

图2 IL-4对LPS活化的Ana-1细胞表达NF-κB蛋白的影响

Tab.2 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of MyD88 in LPS-activated Ana-1 cells表2 IL-4对LPS活化的Ana-1细胞表达MyD88 mRNA和蛋白的影响 （n=5，±s）

Tab.2 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of MyD88 in LPS-activated Ana-1 cells表2 IL-4对LPS活化的Ana-1细胞表达MyD88 mRNA和蛋白的影响 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a与0 h比较，b与0.5 h比较，c与1 h比较，P＜0.05

组别LPS组LPS+IL-4组t MyD88 mRNA 0 h 1.30±0.34 1.26±0.48 0.152 0.5 h 1.68±0.12 1.72±0.43 0.200 1 h 2.14±0.30a 1.52±0.21 3.786＊2 h 2.67±0.43ab 1.21±0.14 3.063＊F 10.372＊1.415 MyD88蛋白（%）0 h 7.36±0.61 7.29±1.01 0.133 0.5 h 15.37±0.44a 16.01±0.84a 1.509 1 h 17.00±0.81ab 12.64±0.32ab 11.942＊2 h 19.37±1.24abc 7.01±0.97abc 17.555＊F 117.998＊82.627＊

Tab.3 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of NF-κB in LPS-activated Ana-1 cells表3 IL-4对LPS活化的Ana-1细胞表达NF-κB mRNA和蛋白的影响 （n=5，±s）

Tab.3 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of NF-κB in LPS-activated Ana-1 cells表3 IL-4对LPS活化的Ana-1细胞表达NF-κB mRNA和蛋白的影响 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a与0 h比较，b与0.5 h比较，c与1 h比较，P＜0.05

组别LPS组LPS+IL-4组t NF-κB mRNA 0 h 0.68±0.09 0.70±0.12 0.298 0.5 h 1.34±0.09a 1.29±0.11a 0.787 1 h 1.99±0.11ab 1.87±0.20ab 1.176 2 h 2.24±0.27ab 2.12±0.33ab 0.629 F 58.106＊27.487＊NF-κB蛋白（%）0 h 2.35±0.32 2.40±0.27 0.267 0.5 h 9.31±0.28a 8.84±0.41a 2.117 1 h 15.33±0.82ab 16.29±0.52ab 2.211 2 h 20.33±0.69abc 19.32±1.07abc 1.774 F 543.807＊419.734＊

2.3NF-κB p65胞核/胞浆比例变化 随着Ana-1细胞培养时间的延长，LPS组NF-κB p65胞核/胞浆比例呈逐渐上升的趋势（P＜0.05）；而LPS+IL-4组呈先上升后下降的趋势（P＜0.05）。LPS+IL-4组NF-κB p65胞核/胞浆比例在0 h和0.5 h时与LPS组差异无统计学意义（P＞0.05），在1 h和2 h时明显低于LPS组（P＜0.05），见表4。

2.4IL-4对LPS诱导的IL-6和TNF-α水平的影响 随着Ana-1细胞培养时间的延长，LPS组IL-6和TNF-α水平呈逐渐升高的趋势（P＜0.05）；LPS+IL-4组则呈先升高后下降的趋势（P＜0.05）。LPS+IL-4组IL-6和TNF-α水平在0 h和0.5 h时与LPS组差异无统计学意义（P＞0.05），在1 h和2 h时明显低于LPS组（P＜0.05），见表5。

Tab.4 Changes of nuclear/cytoplasmic ratio of NF-κB p65表4 NF-κB p65胞核/胞浆比例变化 （n=5，±s）

Tab.4 Changes of nuclear/cytoplasmic ratio of NF-κB p65表4 NF-κB p65胞核/胞浆比例变化 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a与0 h比较，b与0.5 h比较，c与1 h比较，P＜0.05

组别LPS组LPS+IL-4组t 0 h 0.35±0.10 0.34±0.07 0.183 0.5 h 1.21±0.09a 1.05±0.14a 2.149 1 h 1.87±0.15ab 1.06±0.30a 5.400＊2 h 2.71±0.28abc 0.49±0.11bc 16.501＊F 100.931＊13.299＊

Tab.5 Effects of IL-4 on the levels of IL-6 and TNF-α in LPS-activated Ana-1 cells表5 IL-4对LPS诱导的Ana-1细胞中IL-6和TNF-α蛋白表达水平的影响 （ng/L，n=5，±s）

Tab.5 Effects of IL-4 on the levels of IL-6 and TNF-α in LPS-activated Ana-1 cells表5 IL-4对LPS诱导的Ana-1细胞中IL-6和TNF-α蛋白表达水平的影响 （ng/L，n=5，±s）

＊P＜0.05；a与0 h比较，b与0.5 h比较，c与1 h比较，P＜0.05

组别LPS组LPS+IL-4组t IL-6 0 h 60.21±22.58 60.08±18.37 0.01 0.5 h 193.26±17.68a 189.47±24.31a 0.282 1 h 245.36±22.58ab 164.21±15.24a 6.665＊2 h 276.34±26.00ab 142.36±18.67ab 9.359＊F 56.847＊24.972＊TNF-α 0 h 47.25±8.31 46.85±6.37 0.085 0.5 h 211.64±24.80a 208.36±30.33a 0.187 1 h 298.31±40.02ab 176.34±18.64a 6.155＊2 h 381.11±21.22abc 163.24±14.08ab 19.13＊F 89.495＊39.592＊

3 讨论

抗炎细胞因子IL-4主要由CD4+T细胞产生的，可以促进T淋巴细胞活性并增强巨噬细胞吞噬功能。研究表明，IL-4对B细胞、T细胞、肥大细胞和单核巨噬细胞都有免疫调节作用［8］。有研究发现，重症肺炎患者血清中IL-4水平明显升高，提示IL-4可能参与了机体的抗炎过程［9-10］，但其具体抗炎机制尚未明确。

本研究采用LPS刺激Ana-1细胞以激活NF-κB炎症信号通路，结果显示，在LPS的诱导下，小鼠炎症反应细胞模型建立成功：MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平均明显升高，NF-κB p65蛋白核移位增加，同时上调了细胞中IL-6和TNF-α的表达，这与以往文献报道的LPS诱导发生的炎症反应表现一致［11-12］。Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号通路是LPS胞内信号转导的关键途径。LPS通过与TLR4结合，从而诱导TLR4聚合使得信号转导至胞内，胞内TIR区与MyD88的羧基端结合，同时MyD88通过氨基端的死亡域与白细胞介素1受体相关激酶（IRAK）的死亡结构域结合，激活IRAK的自身磷酸化，获得游离的IRAK继而激活肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TRAF-6），TRAF-6激活NF-κB二聚体的抑制蛋白家族（IκB）激酶（IKKs）。IκB由于磷酸化、泛素化后降解，使得NF-κB从静息状态下受IκB结合处于的抑制状态解除，进而导致NF-κB p65转入细胞核中诱导基因转录，启动IL-6、TNF-α等促炎细胞因子基因的表达［13-15］。

Lai等［16］研究显示，IL-4可通过抑制炎症细胞因子的基因转录，影响其mRNA的稳定性，进而下调炎症细胞因子的表达。本研究通过加入IL-4进行干预LPS诱导的炎症反应细胞模型，结果显示，在IL-4干预下，MyD88的mRNA和蛋白表达水平呈先升高后下降的趋势，提示LPS诱导下NF-κB激活导致p65入核增加，使得NF-κB p65胞核/胞浆比例增高；在IL-4的干扰下，进入胞核的p65蛋白减小，活化受到抑制，从而导致NF-κB p65胞核/胞浆比例的下调。

此外，本研究结果显示，在IL-4的干扰下，促炎细胞因子IL-6和TNF-α表达水平也随之出现逆转。而IL-4作用下的TLR4/NF-κB信号通路中只有MyD88发生显著变化，提示IL-4可能通过抑制MyD88而下调NF-κB活性，从而影响IL-6和TNF-α的表达，抑制LPS启动的炎症反应。MyD88作为TLR4/NF-κB信号通路中的关键接头分子，已有研究表明在MyD88基因敲除小鼠中，LPS并不能使血清中IL-6和TNF-α水平增加［17］，提示MyD88在LPS诱导产生炎症反应中发挥着重要作用，而本研究结果进一步提示IL-4可能作用于MyD88而参与抗炎反应。

综上，本研究通过构建IL-4干扰的LPS诱导炎症反应细胞模型，发现IL-4可以逆转由于LPS诱导的促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达上调，可能具有抗炎作用。此外通过检测MyD88/NF-κB信号通路中MyD88和NF-κB的表达和NF-κB p65的核移位，发现IL-4参与的抗炎机制可能与该通路中MyD88的表达下调及NF-κB p65蛋白的核移位有关。但其具体机制还需要进一步研究。