钩藤叶5种活性成分的测定研究

黄舒婷，黄燕俊，梁颖欣，赖志明，文升祥，曾常青*

1广东药科大学中药学院/国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广州 510006；2中山市中智药业集团有限公司，中山 528437；3广东南领药业有限公司，梅州514600；4贵州省剑河县科技局钩藤研究所，剑河 556400

钩藤为常用中药，茜草科植物钩藤Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil是目前钩藤药材市场的主要品种[1]。钩藤化学成分有生物碱类、黄酮类、三萜类、香豆素类及有机酸类等，其中生物碱化学成分已经被广泛的研究，但非生物碱成分研究较少。钩藤叶与其药用部位带钩茎枝化学成分相似[2]，Li等[3]提取分离了钩藤叶3个生物碱和14个非生物碱，并分别进行了抗氧化活性测定。Luo等[4]对黔产钩藤不同部位中总黄酮进行含量测定，发现总黄酮的含量是皮>叶>钩>茎>木质部>薄壁组织。Huang等[5]利用HPLC法测定钩藤植物各个不同部位钩藤碱含量。在民间一直有钩藤叶药用习俗[6]。课题组前期对钩藤植物各部位进行成分和药效活性研究发现：与带钩茎枝药用部位相比，叶子中非生物碱成分含量高，并具有明显的抗氧化活性。目前每年钩藤药材采收时，大量的叶子随带钩茎枝的采摘而被当作废物处理，造成大量的资源浪费。综合开发利用钩藤叶可以降低药用部位的成本，扩大钩藤的药用部位，有益于资源可持续发展。钩藤叶质量控制方法研究较少，本文在钩藤叶抗氧化活性追踪等实验基础上，建立钩藤叶的五种成分的含量测定方法，弥补了目前钩藤叶质量控制方法的不足，为钩藤叶的研究开发提供基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

2695高效液相色谱仪(2996二极管阵列检测器，Waters公司)，CNW C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，上海安谱实验科技有限公司)，UV-1800紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)，KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率为120 W)。

1.2 试药

对照品喜果苷(批号：MUST-16072110)、表儿茶素(批号：MUST-17060114)、绿原酸(批号：MUST-16072110)、芦丁(批号：MUST-16122011)、金丝桃苷(批号：MUST-16102605)纯度均>98%，均购于成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈、磷酸为色谱纯，超纯水，甲醇、没食子酸(含量>98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，其它试剂均为分析纯。

1.3 样品

钩藤叶在广东、贵州和广西等钩藤产地采集，经广东药科大学中药学院曾常青教授鉴定均为茜草科植物钩藤(Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil)的叶子，样品S1～S5，分别采集于贵州省剑河县摆伟村、南明区、敏洞乡、柳川镇、岑松镇；S6采集于贵州省凯里市；S7采集于贵州省兴义市；样品S1～S7，采集于2014年10月。S8采集于广西省三江县；S9采集于广东省韶关市始兴县；S10～S12，分别采集于广东省平远县畲脑村、大拓镇、黄花陂村；样品S8～S12，采集于2016年10月。将钩藤叶样品置于60 ℃烘箱中烘干，打粉，过40目筛备用。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备

取绿原酸对照品约20 mg，表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、喜果苷对照品约10 mg，精密称定，分别置于10 mL的容量瓶中，加70%甲醇使其溶解、定容至刻度，摇匀，即得各对照品母液，备用；其中对照品母液浓度为：绿原酸2.041 mg/mL，表儿茶素1.064 mg/mL，芦丁1.005 mg/mL，金丝桃苷0.986 0 mg/mL，喜果苷1.060 mg/mL。精密量取适量的各对照品母液，置于50 mL的容量瓶中，再加70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，其中绿原酸浓度为0.367 4 mg/mL、表儿茶素浓度为0.085 12 mg/mL、芦丁浓度为0.020 10 mg/mL、金丝桃苷浓度为0.078 88 mg/mL、喜果苷浓度为0.021 20 mg/mL。置于-20 ℃冰箱保存备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

2.1.2.1 抗氧化活性追踪的各部位溶液制备

取贵州剑河县钩藤叶(S4)细粉15 g于500 mL具塞锥形瓶中，加入70%乙醇300 mL，浸泡45 min，超声45 min，滤过。滤液用石油醚萃取，弃去石油醚层，水层浓缩。浓缩液分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，分别得到各部位的萃取液，减压浓缩各部位萃取液，最后于60 ℃减压干燥至恒重。取各个部位固体25 mg，分别配制浓度为0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等部位供试品溶液。

2.1.2.2 五成分含量测定供试品溶液制备

取钩藤叶约0.2 g，精密称定，置于50 mL的具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称重；浸泡30 min，超声30 min，冷却，补重，摇匀，过0.22 μm的有机微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2 钩藤叶抗氧化活性部位追踪

2.2.1 钩藤叶总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法[7]，测定钩藤叶中总酚的含量。以没食子酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=0.152X+0.008 9，r=0.999 3，没食子酸在0～5.00 μg/mL内线性关系良好。分别精密取0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇三个萃取部位的供试品溶液0.5 mL至10 mL的容量瓶，按标准曲线制备方法测定钩藤叶三个萃取部位的总酚含量，结果见表1。

2.2.2 钩藤叶中总黄酮含量测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠[8]，测定钩藤叶中总黄酮含量。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=0.036 6X+0.05，r=0.998 8，芦丁在0～20.0 μg/mL内线性关系良好。分别精密取0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇三个萃取部位的供试品溶液1 mL至10 mL的容量瓶，按标准曲线制备方法测定钩藤叶三个萃取部位的总黄酮含量，结果见表1。

2.2.3 DPPH自由基清除能力测定

参考郭雪峰等[9]DPPH自由基清除能力测定方法。分别精密量取适量0.100 mg/mL的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇三个萃取部位的供试品溶液，置于50 mL的容量瓶中，再加甲醇定容至刻度，摇匀，即得三个萃取部位的不同浓度梯度的供试品溶液，其中乙酸乙酯部位浓度梯度为5.00～25.0 μg/mL；正丁醇部位浓度梯度为10.0～60.0 μg/mL；氯仿部位浓度梯度为10.0～200 μg/mL。依次加入不同浓度的三个部位供试品溶液1 mL、0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液3 mL于各试管中，充分混匀，避光静置30 min后，于519 nm波长处测定其吸光度A0，另同法操作做空白对照，测定其吸光度A1。DPPH自由基清除率的计算公式：Y(%)=(A1-A0)/A1×100%。

清除DPPH自由基能力使用AE表示，AE=1/IC50，AE越大，其清除DPPH自由基的能力越大。结果见表1。

表1 钩藤叶总酚、总黄酮含量和AE值

2.2.4 钩藤叶抗氧化活性物质基础分析

采用SPSS21.0数据处理。结果表明钩藤叶总酚含量与清除DPPH自由基的能力呈显著正相关(P<0.05)，其相关系数为0.999。钩藤叶总黄酮含量与清除DPPH自由基的能力呈极显著正相关(P<0.01)，其相关系数为1.000。由表1结果及相关分析结果可知，钩藤叶清除DPPH自由基的物质基础与酚类和黄酮类成分显著正相关。对三个部位的HPLC色谱图进行分析，根据对照品对照及各色谱峰光谱图分析可知乙酸乙酯部位以绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷等黄酮和多酚类成分为主；正丁醇层以绿原酸、芦丁等极性较大的黄酮苷和生物碱苷等为主；氯仿层以生物碱成分为主。结合课题组药效成分的研究，本文建立钩藤叶中绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、喜果苷等活性成分的HPLC测定方法。

2.3 测定钩藤叶5种成分的HPLC方法研究

2.3.1 检测条件的选择

2.3.1.1 检测波长的选择

分析5种成分的对照品溶液的HPLC色谱峰的光谱图，比较各波长下5种成分色谱峰灵敏度和分离情况，选择354 nm为定量检测绿原酸、芦丁和金丝桃苷的最佳波长，选择226 nm为定量检测表儿茶素和喜果苷的最佳波长(见图1、图2)。

图1 样品与混合对照品的高效液相色谱图(354 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of sample and mixed standards (354 nm)注：1.绿原酸；3.芦丁；4.金丝桃苷。Note:1.Chlorogenic acid;3.Rutin;4.Hyperoside.

2.3.1.2 色谱条件

采用CNW C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A为乙腈；流动相B为0.1%磷酸，梯度洗脱(0 ～ 25 min，8% ～ 13% A；25 ～ 27 min，13% ～ 15% A；27 ～ 55 min，15% ～ 16% A；55 ～ 60 min，16% ～ 22% A；60 ～ 75 min，22% ～ 30% A；75 ～ 80 min，30% ～ 35% A；80 ～ 90 min，35% ～ 35% A)，检测波长为226、354 nm，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温35 ℃。

图2 样品与混合对照品的高效液相色谱图(226 nm)Fig.2 HPLC chromatograms of sample and mixed standards (226 nm)注：2.表儿茶素；5.喜果苷。Note:2.Epicatechin;5.Vincoside lactam.

2.3.2 钩藤叶前处理

2.3.2.1 提取溶剂的考察

取钩藤叶(S8)粉末4份，每份约1 g，精密称定。分别精密加入30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇溶液各100 mL，称重，浸泡30 min，超声45 min，冷却，补足重量，摇匀，过滤膜，按“2.3.1.2”项下色谱条件进行分析，四种提取溶剂制备样品的五成分测定的峰面积结果见图3。综合4种溶剂对各成分的提取情况，选择70%甲醇为最佳提取溶剂。

图3 不同溶剂提取的钩藤叶中5种成分的峰面积Fig.3 Peak area of five components in U.rhynchophylla leaves extracted at different solvents

2.3.2.2 提取时间的考察

取钩藤叶(S8)粉末4份，每份约1 g，精密称定。精密加入70%甲醇溶液100 mL，称重，浸泡30 min，分别超声15、30、45、60 min，冷却、补重，摇匀，过滤膜，按“2.3.1.2 ”项下色谱条件进行分析，不同的提取时间制备样品的五成分测定的峰面积结果见图4。结果发现提取时间为30 min时，五成分已趋于提取平衡，其中绿原酸、表儿茶素、喜果苷提取含量已达最大；继续增加提取时间表儿茶素降解明显。最终选择超声时间30 min为最佳提取时间。

图4 不同时间提取的钩藤叶中5种成分的峰面积 Fig.4 Peak area of five components in U.rhynchophylla leaves extracted at different times

2.3.3 线性关系考察

将“2.1.1”项制备的混合对照品溶液分别稀释0、5、10、50、100、250、500倍，得系列混合对照品溶液，按“2.3.1.2”项下色谱条件测定，其中稀释0倍的混合对照品溶液进样20、30 μL两进样体积；每个浓度分别重复进样2次，峰面积积分平均值为纵坐标(Y)，分别以绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、喜果苷的进样浓度(mg/mL)为横坐标(X)，得回归方程。各成分的线性回归方程、相关系数及线性范围见表2。

表2 五种对照品的回归方程与线性范围

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液20 μL，按“2.3.1.2”项下色谱条件连续进样6次，考察仪器的精密度。结果显示，绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、喜果苷的峰面积RSD分别为0.90%、1.1%、1.7%、1.8%、1.1%。表明仪器精密度良好。

2.3.4.2 稳定性试验

取钩藤叶(S8)样品，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、16、24 h 按“2.3.1.2”项下色谱条件测定，考察供试品溶液的稳定性。结果显示，绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、喜果苷的峰面积RSD分别为0.34%、1.3%、1.2%、0.19%、1.6%。表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.3.4.3 重复性试验

取钩藤叶(S8)样品，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液6 份，按“2.3.1.2”项下色谱条件测定，考察实验方法的重复性。结果显示，绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、喜果苷的平均含量分别为19.76、4.191、0.745 4、3.036、1.317 mg/g，RSD分别为1.9%、2.7%、2.4%、0.69%、2.3%。表明该方法重复性良好。

2.3.4.4 加样回收率试验

取已知含量的钩藤叶(S8)约0.1 g，共取6份，精密称定，分别精密加入5 mL的混合对照品溶液，按“2.1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1.2”项下色谱条件分析，记录色谱图和峰面积，计算5种成分平均回收率及RSD值。结果见表3，平均回收率在96.73% ～ 103.50%，RSD均小于3%。

表3 加样回收试验结果(n=6)

2.3.4.5 样品测定

取不同产地的钩藤叶样品0.2 g，精密称定，按“2.1.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3.1.2”项下色谱条件分析，记录色谱图和峰面积，计算5种成分的含量。结果见表4。

表4 不同产地钩藤叶含量测定(mg/g)

2.4 聚类分析

为评价不同产地的钩藤叶测定成分的差异，对12批次钩藤叶中5种成分的含量测定结果进行聚类分析。采用SPSS21.0 统计软件进行系统聚类分析，选用组间联接聚类方法，采用Euclidean距离作为钩藤叶样品的测度，结果12个产地的钩藤叶可以分为3类，第一类：S7；第二类：S1、S2、S3、S4、S6、S5；第三类：S10、S11、S8、S9、S12。不同产地钩藤叶聚类分析树状图见图5。

图5 不同产地钩藤叶聚类分析树状图Fig.5 Tree diagram of cluster analysis of U.rhynchophylla leaves from different localities

3 结论

对供试品溶液提取方法进行优化时，除对不同溶剂、不同提取时间进行了优化，还对药材取样量进行了考察；结果表明0.1 g取样量已经具有代表性。另外，还对样品的提取溶剂体积进行了考察，发现1∶100的料液比进行提取，五成分含量已经趋于提取平衡。

不同产地的钩藤叶五成分含量测定结果(见表4)表明：绿原酸在五成分含量中明显最高，占五成分总量的63%～78%。钩藤叶五成分含量依产地不同存在明显的差异，可能与不同产地的环境差异有关。根据12批不同产地钩藤叶五成分含量的聚类分析结果(见图5)，广东、广西地区钩藤叶聚为第三类；贵州地区除兴义市产地钩藤叶独立归为第一类外，其余的均聚为第二类。从含量看，产于贵州地区钩藤叶五成分总含量高于广东地区。第二类贵州凯里市、剑河县等地钩藤叶，属于贵州黔东南区域，而独立分类兴义市位于贵州黔西南区域，可能是地区不同种植环境造成的贵州钩藤叶五成分差异聚分为了两类。

钩藤叶药用历史悠久[6]，来源丰富。现代药理学研究表明，绿原酸具有抗氧化、抗菌、抗突变和抗癌变、降血脂和降血压等作用[10]，表儿茶素[11]、金丝桃苷[12]和芦丁[13]等也具有类似功效；喜果苷具有显著抗白血病和抑制肿瘤[14]、抗炎[15]等活性。本课题组前期功效研究发现钩藤叶除明显的抗氧化作用，还有抗炎和镇静等作用。因此这五个成分是钩藤叶的主要功效成分，本文建立了钩藤叶中绿原酸、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷和喜果苷的含量测定方法，为钩藤叶的综合开发利用提供了质量控制方法。