新疆榅桲抗动脉粥样硬化“多成分-多靶点”作用机制的网络药理学研究

吉米丽汗·司马依，艾尼瓦尔·吾买尔，买尔旦·玉苏甫，阿地力江·萨吾提，买买提明·努尔买买提，周文婷*

1新疆医科大学药学院；2新疆医科大学维吾尔医学院，乌鲁木齐 830011

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是众多心脑血管疾病的共同病理基础，也是心血管系统中最常见和最具危害性的疾病。预计到2020年心血管疾病，尤其是AS将成为世界疾病总负担的主要来源之一[1]。AS的病因及发病机制极为复杂，一般认为由脂质代谢异常、遗传和环境等多种因素相关的血管慢性炎症引发的疾病过程[2]。西药治疗AS的作用机制明确但作用效果单一，其副作用多，需要和其他药物联合使用效果更佳。现代中药药理学研究结果表明，天然药物通过多种活性成分发挥调血脂、影响血液流变动力、抗氧化等不同途径的作用，在AS治疗中可能表现为疗效持久且副作用小的特点。

榅桲(CydoniaOblangaMill.COM)，是蔷薇科(Rosaceae)榅桲属(Cydonia)的灌木植物[3]。在我国广泛分布于新疆南部及陕西、东北等地区，且产量较大。现代研究发现榅桲化学成分主要包括糖类、黄酮类、生物碱类、氨基酸及多肽、鞣质、有机酸、挥发油等成分，具有抗氧化、抗炎、抗过敏、免疫抑制、抗肿瘤、抗凝血和抗血栓等作用[4]。本课题组在前期研究中发现新疆榅桲总黄酮对动脉粥样硬化APOE-/-小鼠的氨基酸代谢，脂代谢，能量代谢和炎症反应相关通路有一定调控作用[5]，然而其具体活性物质基础及作用机制尚不明确。因此，本研究通过网络药理学方法预测及筛选新疆榅桲抗动脉粥样硬化的活性成分和作用靶点，进而初步阐明其多成分-多靶点-多通路协同的作用机制，从而为后期进行生物学验证提供理论依据和研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分析平台和数据库

TCMSP分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)为公开的中药系统药理学数据库与分析平台；SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)为用于生物活性小分子靶点预测的数据库；Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)为整合Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD 三大数据库的蛋白质综合数据库。PDB数据库(http://www.rcsb.org/)收集了利用核磁共振、X-ray放射、理论模拟分析得到的蛋白和DNA的三维空间立体结构。Systemsdock(http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)为基于网络药理学的预测和分析分子对接的数据库。DiSGeNET数据库(http://www.disgenet.org/)收集了多种疾病相关的基因。Clue GO为Cytoscape3.6.0软件的插件，可提供基因功能分析集以及归纳相似的生物学过程并实现可视化。

1.1.2 使用软件

Cytoscape软件(版本：3.6.0，https://cytoscape.org)。

1.2 方法

1.2.1 成分的收集与活性成分的筛选

通过文献挖掘进行新疆榅桲主要成分的收集[6]。收集所得的所有化学成分通过TCMSP数据库ADME参数的类药性(drug-likeness，DL)进行活性化合物的筛选[7]。

公式如下：

式中A是给定草药成分的分子描述，B代表该性质在Drugbank数据库中所有分子的平均值。

1.2.2 活性成分作用靶点的预测及筛选

首先，通过TCMSP分析平台和SwissTargetPrediction数据库预测及筛选活性成分对应的靶点。然后，将所有靶点通过Uniprot数据库以“Homo sapiens”(人属)为关键词进行基因-蛋白名称转换，将全部蛋白名称转换为基因名称。之后，将活性成分与基因名称导入Cytoscape3.6.0软件，进而构建成分-靶点网络图(compound-target network)，并进一步用网络拓扑参数中的自由度(degree)的大小来分析活性成分及其作用靶点相互作用的关联度。

1.2.3 AS相关靶点的检索及药物-疾病共有靶点的分析

通过DiSGeNET数据库以“Atherosclerosis， CUI:C0004153”为关键词检索AS相关靶点，并用Bioinformatics & Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)数据库，将按照2.2.2 所述通过degree大小筛选得到的靶点与AS相关的靶点映射后得到药物-疾病共有靶点，并进一步构建韦恩图。

1.2.4 活性成分-靶点分子对接

通过systemsdock数据库进行活性成分与药物-疾病共有靶点的分子对接。首先通过PDB数据库检索药物-疾病共有靶点的PDB ID，导入systemsdock数据库，然后通过Pubmed数据库下载活性成分的2D结构(SDF格式)，导入systemsdock数据库，进行分子对接。按照对接得分(score)来判断活性成分与靶点的匹配度，score越大，配体与受体结合越稳定。通常score≥4.25认为活性成分与靶点具有一定的结合活性；score≥5.0说明活性成分与靶点具有较好的结合活性；score≥7说明活性成分与靶点具有强烈的结合活性[8]。

1.2.5 通路分析与网络构建

将分子对接Score≥5.0得到的靶点，通过ClueGO插件进行分子功能(molecular function) 和生物过程(biological process) 分析以及通路分析(KEGG、Pathways、WikiPathways)。选择种属为人属(Homo sapiens)，本体参考集(ontologies reference set)，kappa评分(kappa score)设为0.4，其余采用默认参数。利用Cytoscape3.6.0软件的关联功能(Merge)构建活性成分-靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 活性成分的筛选结果

DL是指具有良好的临床疗效药物的物理化学性质及生物学特性(包括 ADME/Tox)。Lipinski指出，类药化合物系具有在人体药代药动学过程中表现为较好的 ADME 特性和安全性，在I期临床试验结束后，待进行下一步实验的化合物[9]。从生物学角度看，DL是综合了药代动力学性质与药物的安全性的指标。Swiss ADME 提供了5种不同规则的药物相似性指标(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)，本研究选择了Lipinski五项原则作为活性成分的筛选标准。以系统药理学方法来分析传统中医药时，DL≥0.18为筛选生物活性成分的标准[10]。DL越大，则成药性越高。研究结果表明，通过文献挖掘新疆榅桲共收集到27个化学成分，通过TCMSP数据库按DL值进行筛选得到11个活性成分(表1)。

表1 榅桲活性成分的ADME筛选

注：DL(类药性)筛选标准DL≥0.18，活性成分按照DL的大小来排序。

Note:DL(Drug-like) screening standard DL(≥ 0.18),the active ingredients are sorted according to the size of DL.

2.2 活性成分作用靶点的预测与筛选结果

通过TCMSP分析平台和SwissTargetPrediction数据库筛选得到活性成分对应的388个相关靶点，将靶点通过Uniprot数据库进行基因名称-蛋白名称转换，删除重复的靶点名称后得到255个靶点。将11个活性成分和255个靶点导入Cytoscape3.6.0软件，构建的活性成分-靶点网络图(图1)。在网络图中，一个节点的自由度表示在相互作用网络中与该节点直接相互作用的节点数目，节点的自由度越大则其参与的生物功能越多，其生物学重要性就越强[11]。因此，本研究进一步用网络拓扑参数中的自由度(degree)的大小来分析活性成分及其作用靶点相互作用的关联度。按照degree由大到小排列后筛选degree≥3的靶点，可以得到11个活性成分对应的24个主要作用靶点(表2)。

续表2(Continued Tab.2)

分类Sort 活性成分及其靶点 Activecompoundortarget自由度Degree谷甾醇Sitosterol3靶点TargetnameNuclearreceptorcoactivator2(NCOA2)7ProstaglandinG/Hsynthase2(PTGS2)6DNAtopoisomeraseII(TOP2A)5ProstaglandinG/Hsynthase1(PTGS1)5HeatshockproteinHSP90(HSP90AA1)5Peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma(PPARG)4Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunit,gammaisoform(PIK3CG)4Arachidonate5-lipoxygenase(ALOX5)4Caspase-3(CASP3)4Hyaluronansynthase2(HAS2)4mRNAofPKACatalyticSubunitC-alpha(PRKACA)4Interstitialcollagenase(MMP1)3Trypsin-1(PRSS1)3RetinoicacidreceptorRXR-alpha(RXRA)3Transcriptionfactorp65(RELA)3Tumornecrosisfactor(TNF)3GlutathioneS-transferaseP(GSTP1)3TypeIiodothyroninedeiodinase(DIO1)3RAC-alphaserine/threonine-proteinkinase(AKT1)3ApoptosisregulatorBcl-2(Bcl-2)3TranscriptionfactorAP-1(JUN)3Hemeoxygenase1(HMOX1)3CytochromeP4503A4(CYP3A4)3CytochromeP4501A2(CYP1A2)3

注：筛选标准Degree≥3，共有11个活性成分和24个作用靶点，并按照Degree的大小依次排序。

Note:Screening criteria Degree(≥3) consisted of 11 active ingredients and 24 target sites,which were sorted according to the size of Degree.

图1 成分-靶点网络图Fig.1 The compound-target network注：红色圆圈代表活性成分；蓝色楔形代表主要靶点；图形面积大小由Degree决定，即自由度越大该节点越明显，在网络拓扑结构中关联度越大，生物学重要性就越强。Note:The red circle represents the active compounds;the blue wedge represents the main target;the size of the graphic area is determined by Degree,that is,the larger the degree of freedom,the more obvious the node is,the greater the degree of association in the network topology,the stronger the biological importance.

2.3 AS相关靶点的检索及药物-疾病共有靶点的分析

通过DiSGeNET数据库以“Atherosclerosis， CUI:C0004153”为关键词检索AS相关靶点共1 133个，并用Bioinformatics & Evolutionary Genomics数据库将24个药物靶点与1 133个AS相关的靶点映射后，得到药物-疾病共有靶点10个，包括NCOA2、TOP2A、RXRA、RELA、MMP1、HMOX1、GSTP1、CASP3、AKT1、PPARG并进一步构建韦恩图(图2)。

2.4 活性成分-靶点分子对接结果

通过systemsdock数据库进行11个活性成分与10个药物-疾病共有靶点的分子对接。研究结果显示，11个活性成分中除Beta-carotene以外，其余10个活性成分与10个药物-疾病共有靶点之间对接得分(Score)≥5.0，即具有较好的结合活性(表3)。

图2 药物与疾病靶点的韦恩图Fig.2 The venn diagram of drug targets and disease targets注：左边区域代表药物靶点14个；右边区域代表AS相关靶点1 123个；中间重叠区域代表药物-疾病共有靶点10个。Note:The left region represents 14 drug targets;the right region represents 1 123 AS-related targets;and the middle overlapping region represents 10 drug-disease targets.

表3 活性成分与主要靶点的分子对接(对接得分≥5.0)

续表3(Continued Tab.3)

活性成分Activecompund化学成分号PubChemID靶点Target对接得分Score活性成分Activecompund化学成分号PubChemID靶点Target对接得分Score槲皮素3-半乳糖苷Quercetin3-galactoside44259092CASP36.678槲皮素Quercetin5280343MMP16.660 RELA6.257 RELA6.651 HMOX16.178 GSTP16.169 MMP16.102 RXRA5.995 RXRA5.889 PPARG5.692 AKT15.398山奈酚Kaempferol5280863HMOX17.098芦丁Rutin5280805TOP2A8.355 TOP2A7.07 NCOA28.199 NCOA26.916 PPARG8.093 AKT16.687 GSTP16.766 MMP16.633 CASP36.608 GSTP16.457 RELA6.429 RELA6.292 HMOX16.324 PPARG5.478 MMP16.175氯原酸Chlorogenicacid1794427NCOA26.769 RXRA5.450 PPARG6.545 AKT15.314 HMOX16.394异槲皮素Isoquercitrin5280804NCOA27.125 TOP2A6.207 PPARG6.889 GSTP15.848 TOP2A6.812 CASP35.547 GSTP16.385 RELA5.517 CASP36.228 RXRA5.484 HMOX16.124 AKT15.456 RELA5.908 MMP15.417 MMP15.595

注：筛选标准Score≥5.0，共有10个活性成分和10个作用靶点，并在相同活性成分类别下按照Score的大小依次排序。

Note:Screening Score(≥5.0) consisted of 10 active compounds and 10 target sites,which were sorted according to the size of Score under the same category of active compounds.

2.5 通路分析与网络构建结果

通过 ClueGO 插件进行分子功能、生物过程以及通路分析(图3和图4)。以不同颜色区分不同生物过程，相关分子功能以线段相互连接。研究结果显示(图3)，主要作用靶点的基因功能主要集中在血管平滑肌细胞增殖的调控(PPARG、HMOX1、GSTP1)和烟碱反应的影响(CASP3、HMOX1、RELA)。研究结果还显示(图4)，主要作用靶点调控的通路包括PPAR信号通路(MMP1、PPARG、RXRA)、白脂肪细胞分化的转录水平调控(NCOA2、PPARG、RELA、RXRA)以及肿瘤抑制素M信号通路(AKT1、CASP3、MMP1、RELA)。最后，利用Cytoscape3.6.0软件的关联功能(Merge)构建活性成分-靶点-通路网络图(图5)。

图3 主要靶点的基因功能网络图Fig.3 Functional grouped network for the main targets

3 结论

本课题组前期研究结果显示，新疆榅桲总黄酮对动脉粥样硬化APOE-/-小鼠具有一定抗AS作用，并可调控氨基酸代谢，脂代谢，能量代谢和炎症反应相关通路。研究还发现，新疆榅桲总黄酮对自发性高血压大鼠心肌肥厚具有抑制作用，可抑制H2O2诱导的内皮细胞凋亡，减轻H2O2对内皮细胞的损伤作用[12]。此外，新疆榅桲多糖和总黄酮具有抗血栓以及抗凝血酶诱导血小板聚集作用[13]，推测新疆榅桲作用于心血管疾病的活性成分主要为黄酮类和多糖类化合物。然而，具体活性物质基础及作用机制尚不明确。本研究结果表明，新疆榅桲10个活性成分中quercetin、kaempferol、rutin和isoquercitrin属于黄酮类化合物，amygdalin和quercetin3-galactoside属于糖类成分，这与前期研究结果符合。

图4 主要靶点的通路分析网络图Fig.4 Pathway grouped network for the main targets

图5 活性成分-靶点-通路网络图Fig.5 The active compound-target-pathway network注：圆圈代表活性成分；楔形代表靶点；六角形代表通路。Note:circles represent active compounds;wedges represent targets;hexagons represent pathways.

由ClueGO靶点功能分析结果可知，10个主要作用靶点中PPARG、HMOX1和GSTP1主要与血管平滑肌细胞增殖的调控。血管平滑肌细胞增殖是高血压、动脉粥样硬化、冠心病血管成形术后再狭窄等疾病的重要病理改变，动脉壁中膜血管平滑肌细胞的增殖或肥大是高血压血管壁增厚的主要原因。因此， 根据靶点功能分析推测新疆榅桲可能主要通过调控血管平滑肌细胞增殖抑制其病理改变，影响动脉粥样硬化的发生发展。此外，CASP3、HMOX1、RELA等靶点与烟碱反应相关，而烟碱又称为尼古丁，由吡啶和吡咯烷构成，具有极大的毒性。研究证明，尼古丁能够促进体外大鼠动脉血管平滑肌细胞有丝分裂以及引起血管平滑肌细胞的表型变化，从收缩表型转变为合成表型，从而进行增殖和合成细胞外基质等一系列活动[14]。说明新疆榅桲活性成分可能通过调控血管平滑肌细胞增殖，影响血管平滑肌表型及细胞外基质合成而作用于AS。

通路分析结果显示(图5)，新疆榅桲活性成分的主要作用靶点参与的通路主要包括PPAR信号通路、白脂肪细胞分化的转录水平调控、肿瘤抑制素M信号通路等。其中参加PPAR信号通路的靶点有MMP1、PPARG、RXRA，PPARG是过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG)是目前发现在脂肪组织中调控脂肪酸代谢的核心转录因子，主要分布于脂肪细胞，在血管内皮细胞 、血管平滑肌细胞和单核细胞上也有表达，可促进胆固醇的逆向转运， 抑制血管平滑肌细胞和内皮细胞的增殖，从而抑制泡沫细胞的形成[15]。因此，可以推测新疆榅桲可能通过不同活性成分如熊果酸(ursolicacid)、槲皮素3-半乳糖苷(quercetin 3-galactoside )、谷甾醇(sitosterol)、芦丁(rutin)(对接得分高于7的活性成分)与PPARG结合，进而调控血管平滑肌细胞增殖，从而发挥抗AS的作用。有研究报道[16]，PPARG配体能够抑制MMP-9表达及活性，从而作用于AS。MMP是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)，参与血管平滑肌细胞通过基底膜和细胞外基质迁入内膜的过程。而MMP1能特异降解细胞外成分Zn+2依赖的酶家族，可以降解细胞外基质，导致纤维帽变薄，斑块不稳定[17]。本研究结果可以推测，新疆榅桲活性成分可能通过作用于PPARG和MMP1调控PPAR信号通路，从而发挥抗AS的作用。还有研究报道，槲皮素可抑制血管平滑肌细胞中MMP-1表达，有助于增加斑块的稳定性，从而预防动脉粥样硬化斑块的破裂[18,19]。本研究结果与文献所报道的槲皮素抑制平滑肌细胞的增殖和迁移的实验结果相符合，结果还显示MMP-1与PPARG 之间存在联系，然而尚未有二者相关性的研究报道。我们还推测槲皮素可能通过抑制MMP1表达，影响PPAR信号通路，从而调控血管平滑肌细胞增殖，然而上述假设需要一系列生物学验证进行研究。另外，参与白脂肪细胞分化转录水平调控的靶点有NCOA2、PPARG、RELA和RXRA，其中RELA同时参与烟碱(尼古丁)反应过程。RELA是转录因子p65(transcription factor p65，RELA或NF-κB P65)，是一类重要的细胞核转录因子，能调控许多下游基因的表达，涉及到细胞的粘附、浸润、转移等诸多过程，其表达增强可促进动脉粥样硬化的发生发展。研究证明[20]，一定浓度的尼古丁通过激活NF-κB信号通路，促进NF-κB的磷酸化，导致内皮细胞的过度凋亡和成熟脂肪细胞过度凋亡甚至坏死。脂肪细胞经尼古丁作用后能够进一步激活内皮细胞中RELA蛋白，进而加重尼古丁对内皮细胞的损伤作用，最终导致内皮细胞结构和功能的改变，加速动脉粥样硬化疾病的发生发展。本研究结果可推测，新疆榅桲多种活性成分可通过与NCOA2、PPARG、RELA和RXRA结合，进而调控白脂肪细胞分化，特别是如熊果酸和谷甾醇(对接得分高于7的活性成分)可通过与RELA相结合，抑制RELA的激活，一方面影响白脂肪细胞分化，另一方面，减轻尼古丁对内皮细胞的损伤，保护内皮功能，抑制AS的病程发展，这也是本课题组下一步需要研究和验证的问题。

本研究通过网络药理学系统地阐述了新疆榅桲活性成分，主要作用靶点以及相互作用途径，通过作用网络图初步阐释了新疆榅桲多成分-多-靶点-多途径的特点。本研究预测靶点与本课题组前期研究以及已知文献报道的药理作用相符合，说明靶点预测具有一定准确性。此外，除上述两个信号通路以外，本研究还发现新疆榅桲活性成分还可能参与癌症相关信号通路，对于该类潜在靶点，相关文献研究报道较少，因此为今后新疆榅桲活性成分及其作用机制的研究提供了新的线索和研究方向。