4种竹叶营养成分分析及其黄酮提取物体外抗氧化活性研究

欧阳吾乐，雷福红，杨亚晋，刘莉莉，李青青，郭爱伟*

1西南林业大学生命科学学院；2云南省高校林木生物技术重点实验室，昆明 650224

竹子是禾本科(Poaceae)竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物，全世界记载的竹子约有60属1 200多种，广泛分布于东南亚、印度、中国、日本和南美等地[1]。我国约有30属300余种[2]，而云南有“竹类故乡”之誉，是公认的竹类植物的起源地和现代分布中心之一，有29属220种，特有种在100种以上[3]。竹叶具有一定的药用功效，中国古代许多药典都记载了竹子的药用价值，在《中华本草》中收录了紫竹(Phyllostachysnigra)、淡竹 (Phyllostachysglauca)、苦竹(Pleioblastusamarus)、毛竹(Phyllostachysheterocycla)、慈竹(Neosinocalamusaffinis)、刺竹(BambusablumeanaSchult.f)和桂竹(Phyllostachysbambusoides)等竹，竹叶具有清热除烦、消痰、止咳、健脾、生津利尿等功效，主治热病、烦渴、小儿惊痫、舌疮等[4]。近年来竹子植物化学方面的研究表明，竹叶中含有许多天然活性成分如黄酮类、生物碱、有机酸、萜类、酚类、蒽醌、鞣质、皂甙、多糖等化合物[5]，其中黄酮类化合物是竹叶中重要的活性物质，竹叶中黄酮含量较高的有麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)为2.02%，毛金竹(Phyllostachysnigra)为1.98%，毛竹为1.70%，高节竹(Phyllostachysprominens)为1.55%，较低的有四季竹(Oligostachyumlubricum)(1.18%)和苦竹(1.35%)等[6]。黄酮类化合物由于其结构中酚羟基内邻位酚羟基极易被氧化，因此对活性氧和活性氮等自由基具有很强的捕捉能力，其具有较强的抗氧化功效[7,8]。

我国约有竹林面积 500多万hm2，以每0.07 hm2产200 kg 鲜叶计算，若能利用其中1%用于天然抗氧化剂的开发，每年就可以提供14万t原料，具有广阔的开发前景[1]。本研究以西南林业大学竹园中的4种竹为研究对象，对其竹叶进行营养成分和黄酮分析，并提取了4种竹叶的黄酮提取物，在体外研究了4种竹叶黄酮提取物的抗氧化活性，为竹类资源中天然活性产物的开发利用提供理论依据，对竹叶的综合利用具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 竹叶采集及制备

研究所用竹子来源于西南林业大学竹园，采集莿竹属的观音竹(Bambusamultiplex)，刚竹属的金竹(Phyllostachyssulphurea)和紫竹(Phyllostachysnigra)，慈竹属的孖竹(Neosinocalamusrecto-cuneatus)，采集每种竹的上、中、下三个部位叶子各500 g左右，将新鲜样品灭活(120 ℃烘箱，10～15 min)后在实验室阴干、粉碎，然后将每种竹叶的上、中、下三个部位的竹叶混匀，放置于-20 ℃储藏备用[9]。

1.2 仪器与试剂

RV8 S96旋转蒸发仪(德国IKA)，SG8200HPT超声波清洗器(上海冠特)， M6纤维测定仪(丹麦福斯)，KJELTEC-2300全自动蛋白测定仪(丹麦福斯)，SZF-06A脂肪测定仪(上海新嘉)，TU-1901紫外可见分光光度计(北京普析)。所用试剂均为分析纯。

1.3 竹叶营养成分测定

竹叶营养成分的测定参考Zhang[10]的《饲料分析及饲料质量检测技术》中的方法和步骤，用凯氏定氮法测定粗蛋白(crude protein,CP)，索氏抽提法测定粗脂肪(ether extract,EE)，高温灼烧法测定粗灰分(Ash)，粗纤维(crude fiber,CF)采用酸碱洗涤法测定，高锰酸钾法测定钙(calcium,Ca)，钼黄比色法测定总磷(total phosphorus,TP)，无氮浸出物(nitrogen free extract,NFE)采用差值计算法计算[10]。

1.4 竹叶黄酮的提取及黄酮含量测定

竹叶黄酮提取方法参照Wang等的[11]方法，称取1 g竹叶粉置于250 mL锥形瓶，与15 mL 70%乙醇充分混匀放入超声波清洗器，在功率设30 W，提取25 min，提取3次，合并提取液抽滤，离心(4 ℃、8 000 rpm、10 min)，收集上清液转移至旋转蒸发仪浓缩 (45±1)℃至浸膏状备用。以芦丁为对照品，紫外分光光度计法测定总黄酮含量[11]。标准曲线的回归方程：Y= 1.338x+ 0.000 4，R2= 0.999，Y为吸光度(Abs)，x为标样浓度 (mg/mL)，说明芦丁浓度C(mg/mL)与吸光度Abs之间具有良好的线性关系。

1.5 竹叶黄酮提取物的体外抗氧化研究

1.5.1 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力测定参照Zhang等[12]方法进行，准确称取30.90 mg DPPH溶于250 mL棕色容量瓶中，用纯水将竹叶黄酮提取物稀释成质量浓度为0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL，取1 mL不同浓度的竹叶黄酮提取物与1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于5 mL离心管中，摇匀后立即置于黑暗中反应1 h。用无水乙醇校零，在波长517 nm处测定吸光值为Abs样本。重复以上操作，将样本换成无水乙醇并测定吸光值为Abs空白，用BHT(二丁基羟基甲苯)作阳性对照实验。DPPH自由基清除率计算如下:

SCDPPH(%) = (1-Abs样本/Abs空白) × 100%

1.5.2 ABTS自由基清除方法

ABTS自由基清除实验方法参照Li等[13]的方法进行，竹叶黄酮提取物用纯水稀释成质量浓度为0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL溶液，取0.4 mL不同浓度的竹叶黄酮提取物与4 mL ABTS工作液混合后用旋涡混匀器振摇12 s，静置300 s后用95%乙醇校零，在波长734 nm处测定吸光值并记作Abs样本，然后将样本换成95%乙醇重复上面的实验步骤，测得吸光值记作Abs空白，以BHT作为阳性对照。ABTS自由基清除率计算公式如下：

SCABTS(%) = (Abs空白- Abs样本) /Abs空白×100%

1.5.3 金属螯合能力的测定

金属螯合能力(metal-ion chelating activity)参照Wang等[14]的方法进行，用纯水将竹叶黄酮提取物稀释成质量浓度为0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL，取0.5 mL不同浓度的竹叶黄酮提取物，依次加入1.8 mL甲醇、0.05 mL 2 mmol四水氯化亚铁、0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪，混合均匀避光反应10 min，甲醇校零，在波长562 nm处测定样品的吸光值为Abs样本，空白对照吸光值记作Abs空白，以乙二胺四乙酸(EDTA)作阳性对照。金属螯合能力计算公式如下：

金属螯合能力 (%) = (1-Abs样本/Abs空白) × 100%

1.5.4 亚铁还原能力测定

亚铁还原能力(ferric reducing antioxidant power，FRAP)测定参照Muller等[15]的方法进行。用纯水将竹叶黄酮提取物稀释成质量浓度为0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mg/mL、0.50 mg/mL，将0.5 mL 竹叶黄酮提取物和1 mL的FRAP工作液混合，定容至10 mL，所得蓝色溶液在室温静置20 min，测定593 nm处的吸光值，结果记为A593，1 mL FRAP试剂用双蒸水定容至10 mL并测定吸光值作为空白，以BHT作为阳性对照。

1.6 数据处理

竹叶中营养成分用干物质(dry matter)表示，每份样品均进行3次平行测定，取3次测定值的平均值作为该指标测定的结果。数据用SPSS 20.0进行统计分析，采用单因素方差分析，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示，P< 0.05表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 4种竹叶营养成分和总黄酮分析

竹叶营养成分和黄酮的分析表明(表1)，4种竹叶的CP差异显著(P<0.05)，孖竹叶CP最高(20.74±0.45)%，观音竹CP最低(14.21±0.35)%；从EE来看，观音竹 EE最高(2.92±0.08)%，孖竹EE最低(1.65±0.10)%，EE孖竹与观音竹、紫竹、金竹间差异显著(P<0.05)；4种竹叶中金竹Ash最高(13.6±0.45)%，孖竹最低(7.00±0.23)%；观音竹、紫竹、金竹、孖竹间的Ash差异显著(P<0.05)；CF观音竹最高(28.77± 0.34)%，孖竹(22.19±0.40)% 最低，金竹和紫竹的CF无显著性差异(P>0.05)；4种竹叶中NFE孖竹最高，观音竹、紫竹、金竹无显著差异(P>0.05)；4种竹叶中Ca差异显著(P<0.05)，金竹Ca最高，观音竹最低；4种竹叶TP在(0.12±0.01)% ～(0.15±0.02)%，无显著性差异(P>0.05)；观音竹中黄酮含量最高(1.90±0.25)%，其次为紫竹(1.43±0.12)%，金竹最低(0.37±0.02)%。

表1 4种竹子竹叶营养成分与黄酮分析(%)

注：同列中相同英文字母表示差异性不显著(P> 0.05)，不同英文字母表示差异性显著(P< 0.05)。

Note:The same letters in the same column mean no significant difference (P> 0.05),and different letters indicate significant difference (P< 0.05).

2.2 4种竹叶黄酮提取物的体外抗氧化研究

2.2.1 DPPH自由基清除能力

4种竹叶黄酮提取物对DPPH自由基清除的分析可以看出(图1)，随着竹叶黄酮提取物浓度的升高，4种竹叶黄酮提取物和BHT清除DPPH自由基能力也随之增强，当浓度为0.15 mg/mL时，观音竹黄酮提取物(BMLFE)、紫竹黄酮提取物(PNLFE)、孖竹黄酮提取物(NRLFE)、金竹黄酮提取物(PSLFE)和BHT对DPPH自由基的清除率分别为98.00%、80.88%、71.85%、97.87%及93.60%。总体上来看，4种竹叶中PSLFE清除DPPH自由基的效果最好，BMLFE清除DPPH自由基的效果与BHT接近。

图1 4种竹叶黄酮提取物对DPPH自由基清除Fig.1 DPPH radical scavenging ability of flavonoid extracts from four bamboo leaves注：BMLFE为观音竹黄酮提取物;PNLFE为紫竹黄酮提取物;NRLFE为孖竹黄酮提取物;PSLFE为金竹黄酮提取物;BHT为二丁基羟基甲苯。下同。Note:The BMLFE is flavonoid extracts from Bambusa multiplex leaves;The PNLFE is flavonoid extracts from Phyllostachys nigra leaves;The NRLFE is flavonoid extracts from Neosinocalamus recto-cuneatus leaves;The PSLFE is flavonoid extracts from Phyllostachys sulphurea leaves;BHT is butylated hydroxytoluene.The same as below.

2.2.2 ABTS自由基清除能力

竹叶黄酮提取物对ABTS自由基清除能力的分析可以看出(图2)，随着黄酮浓度的升高，竹叶黄酮提取物和BHT清除ABTS自由基能力也随之增强，当浓度为0.15 mg/mL时，BMLFE、PNLFE、NRLFE、PSLFE和BHT对ABTS自由基的清除率分别为53.18%、52.76%、80.37%、74.11%及90.10%。总体上来看，对ABTS自由基的清除能力大小顺序依次为BHT > NRLFE > PSLFE > PNLFE > BMLFE，4种竹叶中NRLFE和PSLFE清除ABTS自由基的效果与BHT接近，PNLFE和BMLFE清除效果较差。

图2 4种竹叶黄酮提取物的ABTS自由基清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging ability of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.2.3 亚铁还原能力

亚铁还原能力的分析可以看出(见图3)，随着4种竹叶提取物和BHT浓度的增加亚铁还原能力也逐渐增强，当浓度为0.5 mg/mL时，BMLFE、PNLFE、NRLFE、PSLFE和BHT的吸光值分别为0.50、0.49、0.45、0.53和0.25。总体上看，4种竹叶黄酮提取物的亚铁还原能力均比BHT强，4种竹叶中PSLFE亚铁还原能力最强，NRLFE最弱。

图3 4种竹叶黄酮提取物的亚铁还原能力Fig.3 The power of ferric reducing antioxidant of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.2.4 金属螯合能力

一些金属离子在脂质的氧化过程中起催化作用，并诱导自由基和脂质过氧化物的产生，因此具有金属螯合作用的天然产物能间接地起到抗氧化作用。金属螯合能力的分析可以看出(见图4)，4种竹叶提取物和EDTA的金属螯合能力随黄酮浓度的升高而增强，但竹叶黄酮提取物金属螯合能力明显弱于EDTA。在浓度为0.5 mg/mL时，PSLFE与NRLFE金属螯合能力较强，BMLFE最弱。

图4 4种竹叶黄酮提取物的金属螯合能力Fig.4 The metal-ion chelating activity of flavonoid extracts from four bamboo leaves

2.3 4种竹叶黄酮提取物的IC50

IC50值可作为评价抗氧化剂清除自由基能力的指标，4种竹叶黄酮提取物的IC50可以看出(图5)，PSLFE清除自由基50%时所需的黄酮浓度最低，其清除DPPH自由基效果优于BHT，其它依次为BHT、BMLFE、NRLFE和PNLFE；当ABTS自由基清除率达到50%时，BHT浓度最低，依次为NRLFE、PSLFE、PNLFE和BMLFE。总体上看，与BHT相比，4种竹叶黄酮提取物中PSLFE和NRLFE抗氧化效果较好。

图5 4种竹叶提取物的IC50分析Fig.5 IC50 of four bamboo leaves

2.4 竹叶中黄酮含量与抗氧化相关性分析

竹叶黄酮含量与抗氧化活性的相关性差异较大，由表2可知，竹叶中黄酮含量与ABTS自由基清除显著的正相关性，相关系数在为0.72(P<0.05)，而竹叶中黄酮含量与DPPH自由基清除和FRAP无显著相关(P>0.05)，相关系数分别为0.30和0.76。

表2 竹叶中黄酮含量与抗氧化相关性分析

3 结论

许多研究表明，竹叶含有丰富的营养物质和黄酮，陆志科和谢碧霞研究了9种竹叶的营养成分，结果表明，粗蛋白质在10.24%～16.68%，总糖含量14.35%～24.61%，水溶性糖含量7.86%～11.45%，总黄酮含量1.18% ～ 2.02%，多糖6.49%～14.55%[6]。Jiang等[9]研究的10种竹的营养成分表明，其粗蛋白在11.64%±0.70%～19.54%±2.76%，粗脂肪1.91%±0.76%～3.59%±0.32%，竹叶粗纤维在37.58%±2.45%～43.29%±4.10%，钙在0.85%±0.05%～0.93%±0.07%，总磷在0.15%±0.01%～0.27%±0.03%，粗灰分在12.06%±4.32%～16.16%±3.80%。研究表明竹叶中含有丰富的营养和黄酮，尤其是蛋白质、钙、黄酮等，且不同竹种间营养成分和黄酮存在差异。

目前，人类食品和动物饲料中广泛添加人工合成的抗氧化剂来提高食品的稳定性和延长食品的保质期，所用的抗氧剂大多数是人工合成的，如二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对二酚(TBHQ)等，许多动物活体实验已证实，人工合成的抗氧化剂对人和动物机体有一定的毒害作用，甚至有些会致癌、致畸[16]，所以人工合成抗氧化剂的安全性引起了人们的担忧。而对来源于植物中的天然抗氧化剂的兴趣越来越高，尤其是富含黄酮类的植物。研究表明，竹叶含有较高的黄酮，具有很强的清除活性氧自由基和羟自由基的能力。DPPH自由基的清除是一种广泛用于评价植物来源粗提取物或纯化物质清除自由基的常用模型，FRAP和ABTS自由基清除能力经常用于快速评估谷物和蔬菜中各种抗氧化剂的总抗氧化能力。本研究采用FRAP法来反映竹叶黄酮提取物对铁离子的还原能力，用DPPH和ABTS来评价竹叶黄酮提取物对自由基的清除能力，较全面反映了4种竹叶的抗氧化功效，结果表明，金竹黄酮提取物和孖竹黄酮提取物在体外具有较强的抗氧化性。

植物活性成分的抗氧化能力与总黄酮含量间的关系还存在一些争议，许多研究表明，植物中总黄酮含量与抗氧化性存在显著的相关性，即黄酮含量越多其抗氧化性越强，Xu等[17]比较了华南地区5个主要品种番石榴(Psidiumguajava)的总抗氧化能力与黄酮间的关系，结果表明，番石榴的总抗氧化能力与黄酮含量之间具有显著的相关性(P< 0.05)。Bai等[18]研究了啤酒花(Humuluslupulus)废弃枝叶多酚、黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析，结果表明啤酒花主枝、侧枝和叶子多酚、黄酮与抗氧化具有显著的相关性。但也有研究表明，黄酮含量与抗氧化活性无相关性，尚红梅等研究表明，菊苣根的抗氧化活性与其中的黄酮含量关系不大，仅ABTS自由基清除能力与黄酮含量显著正相关，而与总酚含量有很大关系[19]，这与本研究结果一致，本研究表明，竹叶中黄酮含量与ABTS自由基清除显著的正相关性，与DPPH自由基清除和FRAP无显著相关。存在这种差异的原因可能是与植物中黄酮结构的复杂性有关，黄酮类化合物是广泛存在于植物中的次生代谢产物，迄今为止，有9 000多种不同的结构黄酮类化合物被发现，黄酮类化合物具有多羟基、双键、芳香环等特殊结构，具有抗氧化、清除自由基等作用[20]，但不同的黄酮类化合物由于其结构上的差异表现出不同强度的抗氧化，今后应从植物黄酮粗提取物中分离、纯化黄酮，研究其化学结构与抗氧化活性及稳定性关系，为人工合成高效的植物源性抗氧化剂提供指导。