小鼠子宫内膜表面蛋白的二维电泳研究

叶天民 彭鼎佳 肖 佳 杨树标

不孕症是当今困扰人类生殖繁衍的一大问题。虽然目前已经拥有了体外受精等辅助生殖技术，且适宜着床的内膜、优质胚胎的选择等问题均已得到解决，但临床上许多胚胎移植以后仍然难以成功妊娠。其中的主要症结之一在于胚胎的着床问题。而不管对人类还是哺乳动物而言，着床是在一定的时间才能发生的，这段时间称之为着床窗。对人类而言，子宫内膜上皮细胞对于胚胎处于开放接受状态的时间仅在着床窗那几天，一般认为是在排卵后的6～10天。对小鼠而言，着床窗一般在排卵后的4～5天。一旦错过了这个时间，着床将不能发生。

哺乳动物的生殖过程中，胚胎着床是一个非常重要的事件。而且在哺乳动物的不同物种之间，着床的几个基本的步骤都是非常类似的，主要包括定位、黏着和侵入。定位指囊胚于内膜表面不稳定的黏着。此后，黏着步骤指囊胚滋养细胞开始具有黏着能力并黏于子宫内膜表面。接下来滋养细胞穿破内膜腔上皮层，侵入内膜的间质，即侵入过程。这些步骤是在母体甾体性激素的调控下完成的，并且需要胚胎和子宫之间和谐而精密的对话。该系列对话是由诸多分子通路所介导的，包括性激素、细胞因子、生长因子、黏着分子和脂质等[1]。而在子宫内膜腔上皮处于对胚胎接受的着床窗时，上皮细胞的基膜、桥粒、细胞骨架及细胞质会发生改变和变化。所以笔者预测子宫腔上皮细胞表面的一些蛋白对于胚胎的定位和黏着是非常至关重要的。

蛋白质组学技术是目前一项研究蛋白质有效而常用的方法。在笔者的研究中，并没有将整块子宫内膜组织消化和蛋白提取处理后进行分析，而是瞄准了腔上皮细胞表面的蛋白质进行蛋白质组学的研究；因为，着床的早期阶段就是在腔上皮表面发生。在本研究中，笔者将孕第1天(不接受胚胎阶段)及孕第4天(接受胚胎阶段)的小鼠腔上皮表面进行了生物素结合标记，然后提取表面蛋白后进行二维电泳及质谱分析。最后再进行免疫组化学验证。

材料与方法

1.生物素标记小鼠子宫内膜腔上皮表面：本研究所有健康雌性及雄性ICR和GFP小鼠由香港大学实验动物中心提供。所有实验均得到香港大学实验动物伦理学委员会批准。将成年6～8周ICR雌性小鼠分别与正常雄性及行输精管结扎术后的绝育雄性小鼠放在同一笼中过夜。第2天检查雌性小鼠的阴道是否有白色精液栓。有栓的小鼠视为成功交配，此天为孕第1天或者假孕第1天。将与绝育雄鼠交配后假孕第1天及与正常雄性小鼠交配后孕第4天的ICR小鼠进行麻醉。行开腹手术，暴露子宫，每侧宫角处注射25μl生物素标志物(0.25mg/ml，美国Thermo公司)，关腹腔缝合后放回笼内。1h后，将小鼠处死，取出子宫后用眼科镊分离出子宫内膜后用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次。

2.生物素标记蛋白的纯化提取：分离出的小鼠子宫内膜组织，用液氮处理后捣碎，用生物素标记表面蛋白提取试剂盒(美国Thermo Scientific公司)中的裂解液溶解，离心后取上清液。根据试剂盒的实验步骤提取目标蛋白质，进行后续的二维电泳。

3.二维双向电泳及质谱分析：二维电泳参考其他文献的方法[2]。第一维电泳时每次上样量为30μg，胶条为7cm IPG胶(非线性，pH值3～10，美国Bio-Red公司)，之后第二维电泳用12.5%的SDS-PAGE胶进行分离，每一组均用5个样本进行二维电泳。然后进行标准银染。胶样用ImageScan的扫描仪(美国Amersham Biosciences公司)进行高清扫描，得到的图片运用Image Master 2D Elite 4.01软件(美国Amersham Biosciences公司)进行对比分析。经过软件标准化分析后，有差异表达的蛋白对应的胶上的点用刀片切出后进行质谱分析[3]。

4.免疫组化：小鼠内膜组织经过固定、石蜡包埋之后，进行常规石蜡切片制片。切片上组织厚度为5μm。切片经脱蜡后进行处理。GFP小鼠囊胚组内膜直接加上羊抗兔二抗(1∶500)(丹麦Dako公司)处理0.5h，然后用ABC(生物素-辣根过氧化物酶)处理，最后用DAB显色。其他组织切片则用传统免疫组化的抗原修复、过氧化氢处理，加一抗(1∶100)、二抗(1∶500)后用ABC+DAB法显色。其中一抗为兔抗鼠APN和intergrin β1(美国Santa Cruz公司)，二抗为羊抗兔IgG(丹麦Dako公司)。

结 果

1.标记不接受胚胎阶段及接受胚胎阶段小鼠子宫内膜表面蛋白:图1为进行免疫组化染色后的小鼠子宫内膜组织切片，被生物素标记的子宫内膜表面有染色，而对照组未见染色。

2.不接受胚胎阶段及接受胚胎阶段小鼠子宫内膜表面蛋白的二维电泳:将生物素标记的小鼠子宫内膜腔表面蛋白进行分离纯化后，进行了二位电泳，图2为两个不同阶段小鼠子宫内膜表面蛋白二维电泳胶的扫描图。通过Imagemaster软件进行分析后，笔者共发现了47个差异表达超过2倍的蛋白，其中接受胚胎阶段高表达蛋白29个，不接受胚胎阶段高表达蛋白18个；在这里面发现20个差异表达超过3倍的蛋白，其中接受胚胎阶段高表达蛋白13个，不接受胚胎阶段高表达蛋白7个(表1)。图3显示了其中部分差异表达蛋白的放大胶点图。

图1 生物素免疫组化染色后的小鼠内膜组织学图像(×200)A.经生物素标记后孕第1天小鼠子宫内膜组织中的免疫染色； B. 经生物素标记后孕第4天小鼠子宫内膜组织中的免疫染色；C.对照组，未经生物素标记的小鼠子宫内膜组织；LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.间质细胞

图2 孕第1天和第4天小鼠子宫内膜腔上皮表面蛋白二维电泳胶扫描图小鼠子宫内膜腔上皮表面蛋白经过抽提和纯化后第一维用pH值3～10的IPG胶条进行等电聚焦，第二维用SDS-PAGE胶进行电泳，胶进行银染显色A.孕第1天;B.孕第4天

3.差异表达蛋白的质谱分析：将二维电泳中发现的差异表达蛋白进行切胶后提取纯化，并进行质谱分析，差异表达超过3倍的蛋白质，详见表1。

4.部分差异表达蛋白的免疫组化染色:为了验证二维电泳发现差异表达蛋白的结果，检测子宫内膜组织的intergrin β1和AP-N的表达，笔者对孕第1天和孕第4天的小鼠子宫内膜组织切片进行免疫组化染色。intergrin β1在孕第1天小鼠子宫内膜表面的表达明显高于孕第4天小鼠(图3A、B)，AP-N在孕第4天小鼠子宫内膜表面的表达明显高于孕第1天小鼠(图3C、D)，这些结果与二维电泳中发现的结果一致。

讨 论

到目前为止，胚胎的滋养层是如何黏着于可接受胚胎状态子宫内膜并进而完成着床尚不明确。近些年，一些比较蛋白质组学研究运用于小鼠或人类子宫内膜组织的着床相关蛋白的发现和研究[10, 21～24]。这些研究都是对子宫内膜组织的全部细胞蛋白质组学的研究。在笔者的研究中，集中发现了子宫内膜腔上皮细胞表面蛋白的差异表达，这样降低了其他蛋白的信息干扰，集中发现与胚胎黏着有关的蛋白。

表1 不接受胚胎阶段及接受胚胎阶段小鼠子宫内膜表面差异蛋白列表

图3 差异表达蛋白中intergrin β1和AP-N组织学图像(×400)A.intergrin β1孕第1天小鼠子宫内膜组织中的表达； B.intergrin β1孕第4天小鼠子宫内膜组织中的表达；C. AP-N孕第1天小鼠子宫内膜组织中的表达；D. AP-N孕第4天小鼠子宫内膜组织中的表达;LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.间质细胞

为了发现和胚胎黏着相关的蛋白，选取接受胚胎阶段和不接受胚胎阶段的内膜的子宫内膜腔上皮细胞进行蛋白质组学比较。其中的表面蛋白用生物素进行了标记。而且这种标记是不可穿透性的。只有细胞表面的蛋白才会被标记，并且用免疫染色进行了确认，在图1A和B的子宫内膜表面可以见到一层标志物生物素的染色。对于生物素的浓度和作用时间都进行了预实验(这部分数据没有展示)。笔者发现30min的标记时间和0.25mg/ml 的生物素浓度可以得到最佳的效果。因为如果用过大的生物素浓度或者过长的标记时间都会见到内膜间质部出现生物素的踪迹。一般4～5只小鼠的标记蛋白足够用于一个样本的后续实验。

经过抽提纯化后的蛋白通过二维电泳进行分离比较。经过ImageMaster软件的分析，笔者发现了在接受胚胎阶段有12个蛋白高表达，在不接受胚胎阶段有7个蛋白高表达(均>2倍的表达水平)。初步看来蛋白酶活性抑制剂相关蛋白表达升高，可能与滋养细胞侵入阶段溶解相关细胞有关。因为滋养细胞侵入和肿瘤的浸润不完全相同，滋养细胞的侵入需要调控侵入时溶解细胞的数量和深度有关。因为，没有控制的滋养细胞侵入和胎盘植入有相关性。这方面的蛋白在孕期猪的子宫内膜也有明显表达。kininogen-1是硫基蛋白酶抑制剂，此蛋白酶在人类胚胎着床中功能激活[13]。类似的alpha-1-antitrypsin 1-2也是分泌性蛋白酶抑制剂，在水牛的早期胚胎着床阶段有高表达[4]。alpha-2-macroglobulin是一个广谱的蛋白酶抑制剂，和小鼠胚胎着床前定位有关[25]。在差异表达的蛋白中，已经有研究报道过vitronectin和胚胎着床的有关，它是integrin αvβ3的配体，后者是囊胚黏着阶段的重要相关蛋白，也是内膜容受性的重要标记[15]。在小鼠着床中，如果integrin受体被阻断，着床点的数量会显著减少[26]。Annexin A2也是曾经报道过的胚胎着床相关蛋白，在人类子宫内膜中，annexin A2在内膜接受胚胎着床期高表达而在接受胚胎着床的前期为低表达；这些结果说明annexin A2在胚胎着床中有相关的功能作用[14]。近年来，annexin A2在生殖领域的研究在不断深入。目前发现，annexin A2在胚胎着床中的作用是通过RhoA的激活和蛋白的调节而产生的[27]。

在不接受胚胎的阶段发现的高表达蛋白中,很多都是与免疫活性和细胞结构有关。其中有些蛋白如mucin-4和spectrin beta-chain在异位妊娠女性的子宫内膜中有高表达[17]。mucin-4是mucin家族中的一员，是细胞黏附的抑制剂，它在子宫内膜上皮表面的缺失是囊胚黏着的重要前提[28]。而且mucin-4的表达下调是受到性激素调控的[29]。其他蛋白在此阶段的表达已经有相关文献报道过。例如，collagen alpha-1 (Ⅵ) chain在胚胎着床前和着床后均有高表达。

综上所述，笔者通过生物素标记小鼠子宫内膜腔上皮表面，并联合二维电泳发现了一些在接受胚胎着床阶段和不接受胚胎阶段差异表达的表面蛋白，并发现了一些和胚胎着床相关的重要蛋白。