小檗碱联合甲磺酸阿帕替尼对肝癌Hep-G2细胞增殖和凋亡及周期的影响*

谢俊杰，邓波，易峰涛，邵志雄，徐振华

(1.中国人民解放军中部战区总医院放射治疗科，武汉 430070；2.湖北省咸宁市中心医院肿瘤中心，咸宁 437000)

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PLA)是我国第四常见的恶性肿瘤，在肿瘤相关致死病因中排名第三，严重威胁着人民的生命和健康[1-2]。PLA起病隐匿，早期诊断困难，侵袭性高，易发生远处转移，在确诊时大多已属于肿瘤晚期，仅能采取姑息治疗，预后较差。目前，有效且副作用相对较少的治疗PLA的药物几乎没有，因此寻找具有特异性杀伤肝癌细胞或抑制肝癌细胞的新药，成为肝癌治疗的目标。

甲磺酸阿帕替尼(apatinib mesylate)是一种可以口服的新型小分子抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，可高度选择性结合并抑制血管内皮细胞生长因子受体-2 (VEGFR-2)，从而抑制肿瘤血管生成，阻碍肿瘤生长[3-4]。其适应证批准用于晚期胃癌患者。有研究发现甲磺酸阿帕替尼治疗晚期原发性肝癌可提高近期临床疗效，延长患者总生存期，建议推广使用[5-6]；小檗碱(berberine，BBR)是中药黄连、黄柏、三颗针等的主要成分，其抗肿瘤作用是目前研究的一个热点。笔者在本研究拟进一步观察甲磺酸阿帕替尼、小檗碱及两药联合对肝癌Hep-G2细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期分布的影响，初步探讨其在肝癌治疗中的作用及可行性，为进一步扩展PLA治疗手段提供可行方案。

1 材料与方法

1.1试药 小檗碱(成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0152，含量≥98%)；甲磺酸阿帕替尼(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：171228KB，规格：0.25 g)；实验前均用二甲亚砜(DMSO)配置成一定浓度保存液保存于-20 ℃，实验时用小剂量伊格尔培养液(MEM)配置成不同浓度的药液。CCK-8试剂盒(C0038)购于上海碧云天生物技术有限公司；PI染色试剂盒(PAB180014)及Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(PAB180012)均购自bio-Swamp公司。

1.2细胞与细胞培养 人肝癌HepG2细胞购于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，用MEM Hyclone培养基、10%胎牛血清、青霉素-链霉素溶液配置成的完全培养基培养于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)饱和湿度的细胞培养箱中，实验时取对数生长期细胞备用。

1.3CCK-8检测HepG2细胞的增殖抑制作用 取指数生长期细胞，配置成1×103·mL-1的单细胞悬液，保持每孔100 μL接种于96孔板中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后再给予不同浓度小檗碱和甲磺酸阿帕替尼干预细胞，小檗碱浓度梯度设置为12.5，25，50，100，200 μmol·L-1；甲磺酸阿帕替尼浓度梯度设置为0.1，0.5，2.5，12.5，25.0 μmol·L-1；另设阴性对照组(只有细胞和培养基)和空白对照组(只有培养基，没有细胞)。每个浓度设置5个复孔，每个96孔板边缘均加入磷酸盐缓冲液(PBS)100 μL，再分别继续培养24，48，72 h。吸出原液，PBS洗涤1次，每孔中加入用DMEM稀释的CCK-8 液100 μL，再置于培养箱中继续孵育3 h。用酶联免疫吸附测定(ELISA)仪在波长450 nm处测定每孔吸光度(A值)，然后根据公式计算细胞增殖抑制率。再分别计算24 h小檗碱和甲磺酸阿帕替尼25%抑制浓度(IC25值)，并作为联合用药组药物浓度，继续重复上述实验步骤，计算联合用药组干预细胞24，48，72 h后细胞抑制率，实验重复3次。

细胞增殖抑制率(%)=[1-(用药组A值-空白组A值)/(阴性组A值-空白组A值) ]×100%。

1.4流式细胞术检测细胞周期及凋亡变化情况 取对数生长期细胞，清洗消化后制成3×105个·mL-1单细胞悬液，接种于6孔板中，再置于培养箱继续培养24 h，待细胞贴壁后分别设甲磺酸阿帕替尼组、小檗碱组、两药联合组及空白对照组。小檗碱组用30 μmol·L-1小檗碱干预细胞；甲磺酸阿帕替尼用0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼干预细胞；两药联合组加入30 μmol·L-1小檗碱和0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼干预细胞，空白对照组给予完全培养液。继续培养24 h后用PBS洗涤2次，胰酶消化，离心收集细胞，并重悬于Binging Buffer 200 μL中，再根据碘化丙啶(PI)染色试剂盒及Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书进行细胞染色，用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。实验重复3次。

2 结果

2.1CCK-8 实验结果

2.1.1甲磺酸阿帕替尼抑制细胞增殖 不同浓度甲磺酸阿帕替尼作用HepG-2细胞24，48，72 h后细胞增殖受到明显抑制，且随着药物浓度增加、作用时间延长，增殖抑制作用也明显增强(P<0.01)。见表1。经加权直线回归方程计算，甲磺酸阿帕替尼24 h IC25值为0.5 μmol·L-1。

2.1.2小檗碱抑制细胞增殖 不同浓度小檗碱作用于HepG-2细胞24，48，72 h后细胞生长增殖均受到明显抑制，随着药物浓度的增加、作用时间的延长，抑制作用明显增强(P<0.01)。结果见表1。经加权直线回归方程计算，小檗碱24 h IC25值为30 μmol·L-1。

表1 甲磺酸阿帕替尼和小檗碱对Hep-G2细胞增殖抑制的影响

组别药物浓度/(μmol·L-1)生长抑制率/%24 h48 h72 h对照组0.00000甲磺酸阿帕替尼组0.102.54±0.144.07±0.1821.29±0.120.5025.79±0.0928.03±0.2347.25±0.042.5052.51±0.1255.53±0.1268.63±0.1112.565.44±0.1068.26±0.1476.20±0.1525.079.22±0.2181.29±0.1284.51±0.07小檗碱组12.517.40±0.1018.97±0.1425.03±0.2325.022.97±0.0426.82±0.9737.16±0.2150.052.49±0.0456.83±0.1662.27±0.13100.062.46±0.6966.18±0.1571.90±0.01200.070.25±0.2471.23±0.1474.32±0.05

2.1.3两药联合抑制细胞增殖 分别用0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼、30 μmol·L-1小檗碱作为两药联合组用量作用于细胞24，48，72 h，联合用药对细胞增殖抑制作用随着时间延长呈现上升趋势(P<0.01)，24，48，72 h生长抑制率分别为(40.03±0.16)%，(54.91±0.11)%，(60.22±0.04)%。进一步分析显示，同一时间点联合用药对细胞抑制率明显高于甲磺酸阿帕替尼组和小檗碱组(P<0.01)。

2.2细胞周期检测结果 将0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼作用于Hep-G2细胞24 h后，与空白对照组比较，G0/G1期细胞明显增加(P<0.01)，S期及G2/M期细胞明显减少(P<0.01)，表明甲磺酸阿帕替尼可将Hep-G2细胞周期阻滞于G0/G1期；将浓度为30 μmol·L-1小檗碱作用于Hep-G2细胞24 h后，G0/G1期及S期细胞明显减少(P<0.01)，而G2/M期细胞明显增加(P<0.01)，表明小檗碱可将Hep-G2细胞周期阻滞G2/M期；将0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼和30 μmol·L-1小檗碱联合用于Hep-G2细胞24 h后，G0/G1期细胞明显增加(P<0.01)，S期及G2/M期明显减少(P<0.01)，提示联合用药可将细胞周期阻滞于G0/G1期。见图1，表2。

2.3细胞凋亡检测结果 0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼干预细胞24 h后，早期、中晚期细胞凋亡率均高于空白对照组(P<0.01)；将30 μmol·L-1小檗碱干预Hep-G2细胞24 h后，早期、中晚期细胞凋亡率均高于空白对照组(P<0.01)；而将0.5 μmol·L-1甲磺酸阿帕替尼和30 μmol·L-1小檗碱联合用于Hep-G2细胞24 h后，细胞早期、中晚期凋亡率均高于甲磺酸阿帕替尼组和小檗碱组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表3。

图1 甲磺酸阿帕替尼、小檗碱及两药联合对Hep-G2细胞周期的影响

Fig.1Effectsofapatinibmesylate,berberineandtheircombinationoncellcycleofHep-G2cells

表2 阿帕替尼、小檗碱及两药联合对Hep-G2细胞周期的影响

组别G0/G1期S期G2/M期空白对照组55.42±2.9528.47±2.8716.11±1.08甲磺酸阿帕替尼组87.66±1.61∗18.29±1.57∗14.05±0.05∗1小檗碱组48.99±2.45∗121.13±5.86∗129.88±4.06∗1联合用药组86.04±0.92∗18.58±0.94∗15.37±0.94∗1

与空白对照组比较，*1P<0.01

Compared with blank control group，*1P<0.01

3 讨论

近年来，随着分子靶向治疗、基因治疗、细胞免疫治疗等快速发展，以肿瘤基因组改变为基础的精准治疗加速肿瘤分子靶向治疗及免疫治疗的进展。多种基因的突变、细胞信号转导通路和新生血管增生的异常等是参与肝癌的发生、发展、转移和播散的多个关键性环节，是分子靶向治疗的理论基础和潜在靶点[7]。索拉非尼是目前唯一用于治疗晚期肝癌的分子靶向药物，具有抑制肿瘤细胞增殖、抗血管生成的双重作用，被临床试验证明具有延缓晚期肝癌患者肿瘤进展，延长生存期的作用[8-9]。但索拉菲尼总有效率低，不良反应多、价格昂贵，临床使用并不广泛。

图2 甲磺酸阿帕替尼、小檗碱及两药联合对Hep-G2细胞凋亡的影响

表3 甲磺酸阿帕替尼、小檗碱及两药联合对Hep-G2细胞早期、中晚期细胞凋亡率的影响

组别早期凋亡率中晚期凋亡率空白对照组0.05±0.090.00±0.00甲磺酸阿帕替尼组4.61±0.46∗13.94±0.51∗1小檗碱组3.72±0.17∗13.13±0.24∗1联合用药组12.64±1.70∗1∗2∗35.37±0.31∗1∗2∗3

与空白对照组比较，*1P<0.01；甲磺酸与阿帕替尼组比较，*2P<0.05；与小檗碱组比较，*3P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.01；compared with apatinib mesylate group，*2P<0.05；compared with berberine group，*3P<0.05

小檗碱具有疗效明显、毒副作用低等特点，在抗炎、解毒、抗菌和止泻等方面作用突出[10]。近年来，小檗碱的抗肿瘤作用逐步受到重视，小檗碱在消化道系统肿瘤如结肠癌、食管癌，生殖系统肿瘤如前列腺癌、卵巢癌及其他肿瘤如肺癌、人皮肤鳞状细胞癌等均发挥抗肿瘤作用[11-16]，但其在肝癌方面研究仍基本在基础研究上，仅少部分研究发现其具有抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡、引起细胞侵袭、抗肝癌血管生成等发挥抗肿瘤作用。林庆新[17]研究发现黄连素可通过上调p53蛋白表达、下调BCL-2蛋白表达来诱导HepG2细胞凋亡；张卫东等[18]研究发现小檗碱可能通过增加HepG2细胞CDC2蛋白表达，降低CDK4、CyclinBl蛋白表达使其阻滞于S、G2/M期；可能通过增加Caspase-3蛋白表达增加HepG2细胞凋亡；汪玉芳等[19]发现小檗碱可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖和VEGF的表达，所以抗血管生成可能是小檗碱抗肝肿瘤的作用机制之一；王如华[20]发现小檗碱可能通过抑制VEGF表达、改善肿瘤血管形成情况而增强肿瘤细胞的放射敏感性。

甲磺酸阿帕替尼主要应用于胃腺癌患者，虽然在肝癌患者中也应用广泛，但属于超说明书用药。因此，本实验拟通过研究甲磺酸阿帕替尼、小檗碱及两药联合对肝癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响，从而探讨其抗肝癌作用，并进一步探究中西医结合治疗肝癌的临床疗效[21]。

通过实验结果可知两药均能抑制Hep-G2细胞增殖，且均具有时间-浓度依赖性；而两药联合对细胞增殖的抑制作用更加明显，呈现叠加效应；甲磺酸阿帕替尼及两药联合均可将细胞周期阻滞于G0/G1期、小檗碱可将细胞周期阻滞于G2/M期，且两药联合作用时，甲磺酸阿帕替尼起主导作用，这说明小檗碱可协同甲磺酸阿帕替尼起到阻滞Hep-G2细胞周期的作用；而甲磺酸阿帕替尼和小檗碱均能引起肝癌细胞凋亡，甲磺酸阿帕替尼主要引起早期凋亡，小檗碱主要引起中晚期凋亡，两药联合时中晚期细胞凋亡比率更显著，由此推测，在两药联合相互作用诱导细胞凋亡中，小檗碱可能起主导作用[21]。

综上所述，甲磺酸阿帕替尼、小檗碱均能通过抑制肝癌细胞增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡而发挥其抗肝癌作用，两药联合应用时，效果更加明显。