三种精液优化处理技术的多参数对比研究

叶 陈

中山大学附属第六医院生殖中心，广东省广州市 510610

精液优化处理技术作为辅助生殖(Assisted reproductive technology，ART)中的起始重要环节，其能够将非精子细胞成分进行有效剔除，并回收有效功能形态精子细胞，以促进精子获能，为ART后续提供正常形态学精子，提高临床妊娠率[1-2]。近年来，随着育龄夫妇不孕不育率的不断升高，ART技术日臻成熟。目前临床常见的精液处理方法有上游法(Swim-up)、密度梯度离心法(Density gradient centrifugation，DGC)及DGC衍生法。本研究旨在对不同精液优化方法处理后精子精液常规指标及精子完整性等相关参数变化进行对比，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月—2019年5月于我院生殖中心就诊，且禁欲3～5d后采集并送检至男科实验室的100份新鲜精液标本作为研究对象，采集过程中严格按照无菌操作流程进行，根据不同处理方式均分为三组。

1.2 方法

1.2.1 样本采集：所有参与实验者禁欲3～5d后，到院取精，收集标本室温下静置1h，待精液完全液化后均分为三组，采用上游法、密度梯度离心法及联合法进行处理，分为SUP组、DGC组及联合组。

1.2.2 SUP组：取1ml精液液化后以1∶3的比率加入人类输卵管液体(HTF)，混匀后离心5min(300g)，离心管倾斜45°置于37℃培养箱内上游0.5～1h，静置避免晃动。培养结束后，吸取导管上层雨雾状液体，加入2ml HTF液体，混匀，离心5min(1 000r/min)后取上清液，加入0.5ml HTF液，沉淀松散后分层加入HTF液，45°倾斜静置于培养箱内培养20min，吸取上部精液悬浊液。

1.2.3 DGC组：取2ml浓度80%及2ml 40%的密度梯队分离液(SAGE，America)，上层加入2ml液化精液，液体分层界面清晰，离心20min(1 800r/min)取上清液，加入2ml拟人输卵管液(mHTF)及10%血清替代物(SPS)组成的培养液，混匀后离心5min(1 700r/min)，取上清液沉淀团混匀，倾斜45°加入1.5ml洗精剂后，静置37℃ CO2培养箱内，上游1h。

1.2.4 联合组：先进行DGC法，再进行SUP法。

1.2.5 检测方法：精子存活率检测：取三组处理后样本10μl，分别滴于载玻片上，用伊红进行染色，静置30s后在低倍镜下选择分布均匀区域后转高倍镜观察20个视野，计数200个精子，记录未被染上颜色的精子数量，以此计算精子存活率；活力检测：用英国HAMILON精子分析仪分别对处理后的三组样本进行活力检测；精子形态：取样(10μl)均匀涂布于载玻片上，室温下自然干燥，置于95%乙醇固定15min，然后采用传统巴氏染色法镜下染色，待涂片自然干燥后，计数200个完整形态精子，记录其中异常形态精子数，以此计算精子畸形率；DFI(DNA Fracture Index,DNA断裂指数)与HDS(High DNA Stainbility,高DNA可染性)检测；通过BD FACSCalibur流式细胞仪对DFI及HDS水平进行测定，检测试剂盒购自浙江星博生物科技股份有限公司。

1.3 观察指标 比较三组样本精子存活率、活力、形态、DFI及HDS水平。精子存活率=活动精子数量/200×100%；精子活力分级：A级(精子活动良好，运动活泼，快速直线运动)、B级(精子活动，运动快速非直线或直线迟钝运动)、C级(精子活动不良，原地旋转移动)、D级(精子不能活动)，精子活动率=A级活动率+B级活动率+C级活动率；精子形态：畸形精子包括精子头部缺陷、颈部及中段缺陷、尾部异常以及过量胞浆残留，计数过程中凡是异常形态不明显视为异常精子，未成熟圆形精子、无头尾精子不予计数，精子畸形率=畸形精子数量/200×100%。精子DFI和HDS值是精子DNA碎片的两个指标，数值越低表示DNA碎片率低,即精子DNA完整性越好。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料以均数±标准差表示，采用方差分析进行差异比较，组间比较采用SNK-q检验进行，P<0.05则差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组处理后精子基本状态比较 三组处理后精子存活率、活动率比较差异有统计学意义(P<0.05)，组间比较发现，联合组精子存活率、活动率均显著高于其余两组， SUP组显著优于DGC组；三组精子畸形率组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 三组处理后精子DFI、HDS水平比较 三组DFI、HDS比较，联合组DFI、HDS显著低于其余两组，SUP组低于DGC组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

3 讨论

精子优选技术是ART关键所在，随着ART技术的广泛应用，临床上更加期望通过优选技术能够获得更加有效完整的精子。精液处理过程主要是剔除精液中的精浆、细胞碎片及微生物等非精细胞成分，提高正常形态精子数量密度，提高辅助生殖成功率[3-5]。优选技术中较为成熟的方法以SUP及DGC法为主。SUP法原理主要是依靠精子自身运动，通过在精液上加入密度较低的介质，通过精子自发向上移动实现对精液的处理及分离，报道称[6-8]，上游法能够得到高质量、具有完整顶体区域的椭圆形精子，其获得精子存活率高于其他方法，但精子回收率较低，能够筛除染色体异常及不成熟精子，但不能提高完整顶体精子比例。DGC法原理则是根据不同活力及密度精子穿透密度梯度界值速度不同，对精子形态能够进行有效区分，离心后精液各种成分在密度梯度溶液中达到自身平衡，从而根据密度不同分析精子，对抗精子抗体阳性、精浆黏度较大、液化不良的患者具有较高的筛除效率，与SUP法相比，DGC法能够提高精子的回收率，但精子存活率不如SUP法，因此两种方法各有利弊，现目前也有部分研究将两种方法进行合并使用，但对比研究不够充分[9-10]。目前，精子质量评价指标主要以精子活动率、存活率、形态比较为主，随着技术发展，精子DFI值正逐渐成为临床评价精子质量的重要指标，研究证实[11]，含有DNA碎片的精子仍具有使卵子受精的能力，但可能对胚胎发育造成影响，因此DNA完整性是精子优选方法的重要评价指标之一。

表1 三组处理后精子基本状态比较

表2 三组处理后精子基本状态比较

研究结果显示，通过将同质样本分为三组进行实验，比较发现，三组在精子状态比较上，联合组精子存活率、活动率均显著高于其余两组，DFI和HDS值(DNA碎片率的两个指标)显著低于其余两组，SUP组精子存活率、活动率显著高于DGC组，DNA碎片率显著低于DGC组；与相关研究结果相似[12]，对于精子浓度较低患者一般首选采用DGC法进行筛选，对精子浓度较高患者可采用联合法进行，三组精子畸形率进行比较，三种方法对精子畸形率筛选的效率基本相同。对精子DFI及HDS进行比较发现，联合法精子DFI及HDS值显著低于其余两组，而SUP组显著低于DGC组，这表示联合组DNA完整性优于其余两组，而SUP组DNA完整性优于DGC组，这可能与DGC法的离心方式有关，而SUP法与DGC法相比，进行处理后能够获得更多DNA完整精子，研究证实，SUP法能够获得更多端粒均值较长的精子，而联合组虽然进行DGC处理后精子DNA碎片率升高，通过离心后进行SUP能够有效筛选出更加完整DNA的精子，上游后能够更加彻底去除梯度介质，尽量减少介质对精子的影响，联合组与单纯SUP组相比，能够在DGC处理时去除精浆、细胞碎片后再进行上游，减少了非精子细胞在上游过程中产生ROS，减少DNA碎片的产生。

综上所述，与单纯上游法或密度梯度离心法相比较，联合法能够更好地处理精液中非细胞成分影响，减少对精子功能的影响，对提高精子存活率、DNA完整率具有较好作用。