膀胱癌中自噬相关基因Beclin1和Bcl2 mRNA表达相关性及其临床意义

王振龙，汤 辉，李洪亮，薛玉泉，薛 力，钟 铁

(西安交通大学第二附属医院泌尿外科，陕西西安 710004)

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，多表现为间歇性、无痛性血尿。在全球范围内，膀胱癌的发病率居恶性肿瘤第11位，在西方国家泌尿系统恶性肿瘤中的发病率仅次于前列腺癌，位居第2[1]，但在我国是发病率最高的泌尿系统恶性肿瘤，根据《2012中国肿瘤登记年报》统计，我国膀胱癌发病率约为6.6/10万人，在所有恶性肿瘤发病率中排第9位，发病年龄在51～70岁最常见，其中男性发病率约为女性的3～4倍[2]。根据膀胱癌浸润深度及转移情况，可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌，非肌层浸润性膀胱癌包括Tis、Ta、T1，肌层浸润性膀胱癌为T2以上。影响膀胱癌进展的因素有肿瘤分期、分级、肿瘤大小和数量[3]。肌层浸润性膀胱癌患者的预后很差，与肿瘤浸润深度和淋巴结情况有关，5年总体生存率为25%～66%[4-5]。外科手术联合术后膀胱灌注化疗是常用的治疗手段，但是1995至2015年期间，膀胱癌病死率并没有得到显著控制[6-7]。

膀胱癌是由多基因、多步骤调控异常所导致的恶性肿瘤。因此探究阐明膀胱癌发生发展的生物学机制，可为找到针对性治疗膀胱癌提供理论依据。自噬基因Beclin1和B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma2，Bcl2)与肿瘤的发生发展密切相关[8]，但在膀胱癌发病中的机制和关系研究仅停留在蛋白水平，且联合检测这两个基因的表达与膀胱癌相关性的报道很少。因此，本研究拟采用分支-DNA液相芯片法测定膀胱癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中Beclin1和Bcl2 mRNA水平，并分析Beclin1和Bcl2 mRNA表达水平与膀胱癌临床病理特征的关系，为膀胱癌的临床诊断、治疗方案的选择及疗效预测提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本收集2015年1月至2017年12月在西安交通大学第二附属医院泌尿外科就诊的膀胱癌患者组织标本53例，均经影像学检查、实验室检查及手术后病理证实。男性32例，女性21例；年龄38～81岁，中位年龄61岁。所有病例手术前均未接受放、化疗，为初治病例。同期取距离肿瘤组织3 cm处癌旁组织20例作为正常组织对照组。

1.2 样本制备肿瘤组织及癌旁正常组织用生理盐水清洗干净，再用10%的福尔马林溶液(体积分数)固定16～24 h，用乙醇洗涤后，送至广州益善医学检验所(中国广州，广州科学城)进行检测。

1.3 Beclin1和Bcl2 mRNA的表达检测采用分支DNA-液相芯片法，同时检测样本中的Beclin1和Bcl2 mRNA表达。样本裂解后经由微球捕获，利用扩增探针特异杂交对信号放大，通过液相芯片仪读数判断结果，该方法能在一次反应中对多基因mRNA的表达同时测定，具体操作如下：①将裂解液加入一定的待测样品中，55～58 ℃环境下裂解120 min；②裂解后将其转移到孵育板，加入探针-微球、延伸探针及缓冲液于55 ℃环境中震荡孵育过夜；③第2 d把孵育板转移到磁力架上静置1 min，促使磁性微球沉积至底部，吸取上清液并弃之；④去除上清液后将洗涤液加入其中，震荡洗涤1 min，随后再把孵育板转移到磁力架上静置1 min，弃去上清液，反复3次；⑤杂交，加入延伸探针、标记探针，在50 ℃下震荡反应60 min；⑥再次洗涤，将孵育板放在磁力架上静置1 min，弃去上清液，洗涤2次；⑦接着加入链霉亲和素-藻红蛋白，于50 ℃环境下震荡反应30 min，然后将孵育板放置在磁力架上1 min，弃去上清，洗涤2次；⑧读数，加入洗涤液后震荡5 min，通过Luminex阅读仪(Luminex公司，美国得克萨斯州)读取数据，并分析获得的检测结果。

1.4 结果判定Beclin1、Bcl2 mRNA表达水平以高、中、低表示，表达水平大于或等于75%为高表达，65%～75%为中偏高表达，40%～65%为中表达，40%～25%为中偏低表达，小于25%为低表达。将高表达、中偏高表达记为高表达[Beclin1(+)、Bcl2(+)]；中表达、中偏低表达和低表达记为中低表达[Beclin1(-)、Bcl2(-)]，如图1所示。

图1 mRNA表达分布划分图

1.5 统计学分析采用SPSS 18.0软件，计数资料的比较采用χ2检验，配对资料的关联性分析采用Person或Spearman相关系数来描述，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 膀胱癌组织和癌旁组织中Beclin1、Bcl2 mRNA的表达膀胱癌组织中Beclin1和Bcl2 mRNA的高表达率分别为45.3%和26.4%，均显著低于癌旁正常组织的90.0%和55.0%，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 膀胱癌组织和癌旁组织中Beclin1、Bcl2 mRNA的表达 [例(%)]

2.2 Beclin1、Bcl2 mRNA表达与膀胱癌临床病理的关系在膀胱癌组织中，Beclin1 mRNA的高表达率在不同病理分级、临床分期、生长方式以及淋巴结转移状态之间差异有统计学意义(P<0.05)；Bcl2 mRNA高表达率在不同病理分级、临床分期以及淋巴结转移状态之间差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同病理分级、临床分期、生长方式以及淋巴结转移状态膀胱癌组织中Beclin1、Bcl2 mRNA的表达 [例(%)]

2.3 膀胱癌中Beclin1和Bcl2 mRNA表达的相关性分析对53例膀胱癌组织中Beclin1和Bcl2 mRNA的高表达率和中低表达率进行Spearman相关分析，结果显示，膀胱癌组织中Beclin1和Bcl2 mRNA两者的高表达率之间呈负相关(r=-0.287,P=0.037)。

3 讨 论

目前认为，肿瘤的发生发展与细胞增殖失控和细胞死亡抑制密切相关。细胞的3种程序性死亡方式分别为细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬。细胞凋亡又称Ⅰ型程序性死亡，是一种不同于坏死及自噬性死亡的细胞生理性死亡方式，它是受一系列基因调控的有序性死亡[9]。Bcl2基因是细胞凋亡抑制基因，在抑制细胞凋亡过程中发挥重要作用。Bcl2基因编码的蛋白质可以抑制细胞凋亡途径，延长细胞生存并增加细胞分裂，导致细胞过度异常聚集，促进肿瘤的发生发展。在前列腺癌和乳腺癌组织中，Bcl2的表达显著升高[10]。但是在膀胱癌发生发展中的作用未见相关报道。本研究中，凋亡抑制基因Bcl2 mRNA在膀胱癌组织中的高表达率低于癌旁正常组织，且随着病理分级和临床分期的升高，高表达率也逐渐升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示在膀胱癌发生发展中，凋亡抑制基因Bcl2发挥了重要作用。

细胞自噬也称为Ⅱ型程序性死亡，是细胞利用溶酶体降解体内多余的蛋白质和亚细胞成分的催化过程[11]。研究表明，细胞自噬的发生与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[12]。自噬基因Beclin1是参与哺乳动物自噬调控的特异性基因，具有调节细胞存活、分化和生长的作用，可以通过提高细胞自噬从而抑制肿瘤细胞的凋亡。在肺癌细胞A549中敲除Beclin1基因，会促进细胞生长，抑制细胞凋亡[13]。研究表明，Beclin1的表达在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌组织中分别下降了40%、50%、75%[14]。本次研究结果显示，膀胱癌组织中Beclin1 mRNA的高表达率低于癌旁正常组织。提示在膀胱癌发生早期，细胞自噬可能被抑制，与段振玲等[15]在卵巢癌中的研究结论相似。Beclin1 mRNA的高表达率与膀胱癌病理分级、生长方式、TNM分期和淋巴结转移等预后影响因素有关(P<0.05)，肿瘤分化程度越低，Beclin1 mRNA高表达率越低。在恶性程度更高的膀胱癌(T2～T4期)中，Beclin1 mRNA高表达率更低。李飞等[16]采用免疫组化方法研究Beclin1蛋白在膀胱癌组织中的表达，本研究结果与之一致，表明在膀胱癌发展恶化过程中，Beclin1基因表达发挥重要作用，证明Beclin1可作为膀胱癌诊断和治疗新的生物标记物。

本研究采用分支DNA液相芯片技术检测Beclin1和Bcl2 mRNA表达，与常用的mRNA表达检测方法逆转录-聚合酶链反应技术(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)不同，分支DNA液相芯片法可直接对样本裂解并进行检测，不需要对样本进行RNA抽提、纯化、逆转录和目标片段扩增，减少了积累误差，因此，最大程度保证检测结果的可靠性。同时通过扩增探针进行信号放大，极大程度提高了检测的灵敏度。

本研究还进一步分析了Beclin1和Bcl2 mRNA表达的相关性，发现膀胱癌组织中Beclin1和Bcl2 mRNA两者的高表达率之间呈负相关(r=-0.287,P=0.037)。提示自噬和凋亡可能均参与了膀胱癌的发生发展，Bcl2表达对Beclin1相关的细胞自噬起负调节作用，其可能的机制是Beclin1的BH3区域可以和Bcl2结合，导致Beclin1调控的自噬作用减弱，细胞的凋亡抑制和增殖作用增强，该机制在卵巢癌细胞实验中已被证实[17]。因此，可通过抑制Bcl2与Beclin1的BH3区域结合，从而进行膀胱癌的治疗。

综上所述，在肿瘤发生发展的不同阶段，多种基因发挥着不同的作用，本实验证实Beclin1和Bcl2 mRNA表达异常与膀胱癌的发生发展密切相关，联合检测Beclin1和Bcl2 mRNA表达对于膀胱癌的临床分期、预后判断具有重要作用。但是由于膀胱癌发生发展的复杂性，且本实验并未深入研究Beclin1和Bcl2相互调控的分子机制，为精确了解膀胱癌的发生发展机制，寻找针对性的膀胱癌精准治疗方案，需要更深层次地研究膀胱癌中Beclin1和Bcl2 mRNA相互作用的调控机制。