白藜芦醇抑制膀胱癌细胞体外侵袭能力的研究

张 栋，杨小杰，雒启东，付德来，李钊伦，张 鹏，种 铁

(西安交通大学第二附属医院泌尿外科，陕西西安 710004)

白藜芦醇(resveratrol，Res)是广泛存在于葡萄、花生和多种药用植物中的一种多酚类化合物，其具有抗炎、抗氧化、保护心血管及抗肿瘤等多种生物学作用[1-3]，但其在膀胱癌中的作用少有报道。我们前期研究发现Res可抑制膀胱癌5637和T24细胞增殖并诱导其凋亡，本研究通过观察Res对膀胱癌T24细胞的迁移及侵袭能力的作用，探讨Res对膀胱癌细胞远处转移能力的影响及其机制，为膀胱癌的治疗提供新的思路与策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料膀胱癌T24细胞株购自上海中科院生物化学与细胞生物学研究所。主要试剂Res购自美国Sigma-Aldrich公司，基质胶(Matrigel)购自美国BD公司，RPMI 1640细胞培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，反转录试剂盒购自美国Promega公司，MMP-2与MMP-9抗体均购自美国Santa Cruz公司，ECL发光试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 用含10%胎牛血清(体积分数)的RPMI 1640培养基在37.5 ℃、5% CO2(体积分数)的培养箱内培养，以1.25 g/L胰酶和0.2 g/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)的混合液消化传代。

1.2.2划痕试验 收集对数生长期T24细胞接种至6孔板，待其面积汇合至接种板的90%后，用尖端粗细相同的10 μL枪头划数条直线，洗去刮起漂浮的细胞，加入30 μmol/L Res或二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，于24、48 h后采集图像，观察细胞迁移情况。

1.2.3体外侵袭实验 应用24孔、膜孔径8 μm的Transwell小室检测细胞的体外侵袭能力。将Matrigel与无血清RPMI-1640培养基按1∶5的比例稀释后，每室50 μL铺于Transwell小室上室底部，置于37 ℃培养箱待其凝固。30 μmol/L Res处理24 h后，将100 μL含有5×104个 T24细胞的悬液接种于Transwell上室，每种细胞复种3室，同时复种DMSO对照组；下室加1 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基。于37.5 ℃、5%CO2的培养箱内培养24 h与48 h后取出小室，用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)清洗，棉签擦拭上室附着的细胞。将已经侵入下层并贴附于微孔滤膜的细胞用40 g/L多聚甲醛固定5 min，吉姆萨(Giemsa)染色8 min，PBS清洗3次。显微镜下观察，每张微孔滤膜随机选3个视野进行细胞计数。

1.2.4实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RTPCR) 检测MMP-2与MMP-9的表达Trizol试剂提取细胞RNA后，按照反转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，扩增50个循环。通过标准曲线计算Ct值，以GAPDH为内参，计算2-ΔΔCt值。引物序列如下：MMP-2上游引物：5′-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT-3′，MMP-2下游引物：5′-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3′，MMP-9上游引物：5′-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3′，MMP-9下游引物：5′-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT-3′。

1.2.5蛋白印迹试验(Western blot) T24细胞按每孔1×106个密度接种至6孔板。用30 μmol/L Res培养24 h与48 h后，冰PBS小心洗涤，蛋白提取液提取总蛋白。12.5% SDS-PAGE电泳分离，电转法转至偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用MMP-2、MMP-9抗体4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育0.5 h，蛋白条带ECL试剂盒显色发光。

2 结 果

2.1 Res可抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力30 μmol/L Res处理膀胱癌T24细胞24 h与48 h后，检测T24细胞迁移能力。结果发现，Res显著抑制T24细胞体外迁移能力，Res组较对照组细胞迁移能力显著降低(图1)。

2.2 Res可抑制膀胱癌T24细胞体外侵袭能力在验证了Res可抑制T24细胞体外迁移能力后，我们进而检测了Res对T24细胞侵袭能力的影响。结果表明：30 μmol/L Res处理膀胱癌T24细胞24 h后，其侵袭能力受到显著抑制(P<0.05，图2)。

2.3 Res可抑制膀胱癌T24细胞MMP-2与MMP-9的表达Res处理T24细胞24 h与48 h后，应用Real-time PCR与Western blot检测MMP-2与MMP-9的表达变化。结果提示，Res可从mRNA与蛋白水平显著抑制T24细胞MMP-2与MMP-9的表达，且呈时间依赖性(P<0.05,图3)。

图1 划痕试验检测Res及DSMO不同培养时间的迁移能力

图2 Transwell小室检测Res和DMSO在不同培养时间的侵袭能力

图3 Real-time PCR及Western blot检测Res作用下膀胱癌T24中MMP-2与MMP-9的表达

A：Res处理后Real-time PCR检测MMP-2与MMP-9的表达量，*P<0.05；B：Res处理后Western blot检测MMP-2与MMP-9的表达。

3 讨 论

Res是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，广泛存在于蓼科植物虎杖的根茎与根，豆科植物花生的种子，葡萄科植物葡萄果实的皮与籽等[4-5]。Res最初在1924年被发现，但近年来才逐渐受到重视并广泛加以研究。目前的研究表明Res具有抗炎、抗氧化、抑制动脉粥样硬化和血栓形成以及抗肿瘤等多种生物学功能[1-3,6-8]，其中抗肿瘤作用最令人关注。Res对多种实体肿瘤如肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌等具有显著的抑制作用[9-11]，但对膀胱癌的作用目前知之甚少。我们前期研究发现，Res可抑制膀胱癌5637和T24细胞增殖并诱导细胞凋亡，并且可以提高膀胱癌细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡作用[12]。本研究中我们检测了Res对膀胱癌T24细胞迁移与侵袭能力的影响。Res处理T24细胞24 h与48 h后，膀胱癌细胞体外迁移能力显著下降。我们进而应用Matrigel模仿细胞外基质测定Res对T24细胞侵袭能力的影响，发现Res处理T24细胞24 h与48 h后，对照组穿膜细胞数较Res处理组细胞穿膜数显著增多(P<0.05)，提示Res可抑制T24细胞体外迁移与侵袭能力。

肿瘤微环境是近年来的研究热点，是指由肿瘤局部的各种细胞、细胞外基质、酶和细胞因子等共同构成的微环境。其中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是肿瘤的天然组织学屏障，ECM或基膜的降解是肿瘤侵袭与远处转移的关键环节[13-14]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一个大家族，主要功能是降解ECM，在胚胎发育、血管生成、纤维化疾病及恶性肿瘤的浸润与远处转移等病理生理过程中发挥着重要的作用。其中Ⅳ型胶原酶为研究最多的一类，它主要有两种形式：一种被糖化，分子量为92 ku，命名为MMP-9；另一种非糖化，分子量为72 ku，被称为MMP-2。当前对MMP-2，MMP-9的研究较深入，MMP-2和MMP-9又称明胶酶或Ⅳ型胶原酶，可以通过降解基膜主要成分Ⅳ型胶原，促进多种恶性肿瘤的侵袭和转移[15-16]。最近的研究显示：Res能明显抑制肺癌、乳腺癌细胞及胶质瘤细胞MMP-2和MMP-9表达[17-19]。本研究结果显示Res处理膀胱癌细胞后，细胞侵袭能力显著下降，且细胞中MMP-2和MMP-9表达水平明显降低，提示Res可能通过抑制MMP-2和MMP-9的表达从而抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。

综上，我们的结果证实Res可能通过下调膀胱癌T24细胞中的MMP-2与MMP-9的表达而抑制其体外迁移与侵袭能力，Res可能成为临床膀胱癌治疗的新策略。