微小核糖核酸miR-613通过下调E2F5的表达抑制前列腺癌细胞增殖

何 岩，韩广业，刘 沛，李泽宇，李建昌，吴春磊

(新乡医学院第一附属医院泌尿外科，河南卫辉 453100)

微小RNA(miRNA)是一类含有18～24个核苷酸的短小非编码RNA，可以结合信使RNA(mRNA)的3′非翻译区(3′-untranslated regions,3′-UTRs)，然后促进miRNA-mRNA诱导沉默复合物形成，并降解靶向的mRNA[1]。已有很多研究表明miRNA参与多种生物学过程，如细胞分化、增殖、凋亡和转移[2]。miRNA与癌症的发生密切相关，主要作为潜在的致癌基因和肿瘤抑制基因发挥作用，越来越多的数据显示，miRNA是新型治疗靶点和生物标志物的新兴候选者，能够预测肿瘤患者的预后[3-4]。miR-613在多种肿瘤中表达异常，并可能与肿瘤的预后相关，参与调剂多种肿瘤细胞的侵袭、转移和增殖等生物学过程，如乳腺癌、肝癌、前列腺癌等[5-7]。因此，2016年9月至2018年2月期间，我们实验组用前列腺癌细胞系PC3和LnCap细胞为研究对象，研究miR-613在前列腺癌中的表达及对前列腺癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料miR-613和miR-NC(广州锐博生物科技有限公司)；人前列腺上皮细胞RWPE-1以及人前列腺癌细胞系LnCap、DU145和PC3；胎牛血清、Opti-MEM®无血清培养基、Keratinocyte-SFM培养基(美国GIBCO公司)、RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；Lipo 3000转染试剂、PCR引物(上海Invitrogen公司)；SYBR Green Real Time PCR Master Mix试剂盒、PrimeScriptTMRT-PCR逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、All-in-oneTMmiRNA qPCR kit(广州复能基因公司)；一抗鼠抗E2F5(英国 abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗小鼠IgG(武汉博士德公司)、一抗GAPDH(武汉博士德公司)；Cell Counting Kit-8试剂盒(上海碧云天公司)；RNA酶抑制剂(美国 Sigma公司)；Dual-Luciferase Reporter System (美国Promega公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)；超敏ECL发光试剂盒(美国 Millipore公司)。

1.2 前列腺癌组织提取及细胞培养前列腺癌组织和前列腺正常组织于2017年5月至10月收集于河南省新乡医学院第一附属医院泌尿外科。B超引导下前列腺组织细针穿刺标本，并行病理检测，免疫组化确诊为前列腺癌组织或正常组织，分别选取15例，提前获取患者知情同意和伦理委员会的批准。人前列腺上皮细胞RWPE-1用Keratinocyte-SFM培养基，人前列腺癌细胞系PC3、DU145和LnCap细胞，用含10%胎牛血清(体积分数)的RPMI 1640培养基，均在5% CO2(体积分数)、37 ℃孵育箱中培养。

1.3 miRNA、质粒及细胞转染对照正义链序列：5′ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]3′，反义链序列：5′UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT]3；miR-613序列：3′CCGUUUCUUCCUUG UAAGGA5′；过表达E2F5质粒构建为pcDNA3-E2F5和pcDNA3-空白。细胞接种于6孔细胞培养板，转染时细胞汇合度为50%～70%。对前列腺癌细胞系PC3和LnCap细胞行不同处理：阴性对照组(miR-NC或pcDNA3-空白)和实验组(miR-613或miR-613+pcDNA3-E2F5或miR-613+pcDNA3-空白)。种板12 h后，采用转染试剂Lipofectamine®RNAiMAX进行转染实验，保证miRNA的终浓度为100 nmol/L，24 h后更换培养液。

1.4 总RNA的提取和qPCR分析转染后72 h收集细胞用于分析E2F5 mRNA表达情况。用Trizol Reagent提取总的RNA。使用PrimeScript RT Master Mix逆转录RNA为cDNA，然后使用特异性引物及SYBR Green Real Time PCR Master Mix通过qPCR将cDNA进行扩增检测，以GAPDH和U6作为内参，结果数据采用2-ΔΔCt方法分析。E2F5引物序列：上游引物5′CACCTTCTGGTACACAACT GG3′；下游引物5′GGGCTTAGATGAACTCGAC TC3′；GAPDH引物序列：上游引物5′TCCCATCAC CATCTTCCA3′，下游引物5′CATCACGCCACAG TTTCC3′。

1.5 蛋白质印迹实验转染后72 h收集细胞用于蛋白表达的分析。加入细胞裂解液(RIPA)，其中含有蛋白酶抑制剂(PMSF)，置于冰上(4 ℃)裂解30 min，12 000 g离心15 min收集上清。然后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质的浓度。每样本加25 μg蛋白质到SDS-PAGE凝胶行电泳，然后转至PVDF膜，用TBST溶液(含5%牛血清白蛋白)室温下封闭1 h，分别与一抗鼠抗E2F5(1∶1 500稀释)、一抗鼠抗GAPDH(1∶400稀释)4 ℃孵育过夜。第二天用羊抗鼠的二抗(1∶5 000稀释)、室温下孵育1.5 h，使用电化学发光(electro chemi luminescence，ECL)曝光显影。

1.6 CCK-8细胞增殖实验采用96孔细胞培养板，每孔接种细胞约为2 500个，转染后连续4 d分别采用Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖能力。每24 h取出转染后待检测的96孔细胞培养板；避光，加入100 μL的MTS稀释液(10 μL MTS试剂和90 μL含10%FBS1640培养基)，于37 ℃细胞培养箱内静置2 h；然后用酶标仪(450 nm)检测吸光度A值；以后3 d在固定时间检测，且条件保持一致。

1.7 集落形成实验转染细胞24 h后，消化细胞并重新接种于6孔细胞培养板，每孔2 500个；每2～3 d更换培养基，持续培养10 d；PBS洗3遍；然后加入1 mL甲醇室温下固定30 min；倒掉甲醇溶液，用0.1%结晶紫溶液室温固定25 min；流水缓慢洗去染液；干燥后拍照、分析计数。

1.8 荧光素酶测定在转染前一天将PC3细胞接种在96孔板中，miR-613或阴性对照与E2F5 3′-UTR野生型(Wt)或突变型(Mt)报告质粒共转染。根据说明书用双荧光素酶报告系统(Promega，美国)测定荧光素酶活性。

2 结 果

2.1 前列腺癌组织及前列腺癌细胞系中miR-613相对表达量qPCR结果显示，前列腺癌和正常前列腺组织中miR-613相对内参U6的表达量分别为(1.239±0.125，n=15)和(2.758±0.265，n=15)，与正常前列腺组织相比较，前列腺癌组织中miR-613呈低表达，差异有统计学意义(t=5.18，P<0.05，图1A)；前列腺上皮细胞(RWPE-1)及前列腺癌细胞系(LnCap、DU145、PC3)中miR-613相对内参U6的表达量分别为(1.022±0.187)、(0.337±0.106)、(0.408±0.182)和(0.365±0.121)，与正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)相比较，前列腺癌细胞系(LnCap、DU145、PC3)中miR-613相对表达量显著减少，差异具有统计学意义(P<0.01,图1B)。

图1 前列腺癌细胞系和前列腺癌组织中miR-613相对表达情况

A:前列腺癌组织(n=15)；B:前列腺癌细胞系(U6作为内参)。*P<0.05；**P<0.01。

2.2 蛋白质免疫印迹实验和MTS细胞增殖实验蛋白质免疫印迹实验结果(表1)显示，miR-613能够明显抑制E2F5表达，而pcDNA3-E2F5则能够明显上调其表达，差异均有统计学意义(P<0.05，图2A、2D、2G、2I)。

CCK8增殖实验结果(表2、表3)显示，miR-613能够明显抑制PC3和LnCap细胞的增殖，而过表达E2F5后则能够逆转miR-613诱导的抑制PC3和LnCap细胞增殖效应，差异均有统计学意义(P<0.01，图2C、2F、2H、2J)。

蛋白名称Control组miR-613组t值P值miR-613+pcDNA3-空白组miR-613+pcDNA3-E2F5组t值P值PC3细胞E2F50.983±0.1470.452±0.1214.831P<0.050.221±0.0850.526±0.1073.866P<0.05LnCap细胞E2F50.962±0.1690.339±0.1155.279P<0.050.314±0.0510.722±0.1056.054P<0.05

表2 PC3转染miRNA和E2F5过表达质粒共转染后细胞吸光度

组别3 d吸光度(A)F值P值4 d吸光度(A)F值P值Control组1.10±0.1514.730.0051.45±0.1485.4<0.01miR-613组0.55±0.080.73±0.10miR-613+pcDNA3-空白组0.63±0.0616.530.003 60.75±0.09103.3<0.01miR-613+pcDNA3-E2F5组1.06±0.091.35±0.11

表3 LnCap转染miRNA和E2F5过表达质粒共转染后细胞吸光度

组别3 d吸光度(A)F值P值4 d吸光度(A)F值P值Control组1.03±0.0996.41<0.011.53±0.07210.3<0.01miR-613组0.46±0.060.83±0.07miR-613+pcDNA3-空白组0.71±0.0413.30.006 50.86±0.07111.3<0.01miR-613+pcDNA3-E2F5组1.12±0.081.23±0.07

2.3 细胞集落形成实验集落形成实验结果表明，转染pcDNA3-空白组、转染miR-613+pcDNA3-空白组和转染miR-613+pcDNA3-E2F5组中PC3细胞集落形成数目分别为(0.319±0.081)、(0.124±0.047)、(0.329±0.117)；LnCap细胞集落形成数目分别为(0.252±0.056)、(0.106±0.044)、(0.314±0.112),与转染pcDNA3-空白组相比较，转染miR-613+pcDNA3-空白组PC3细胞集落形成数目显著减少，差异有统计学意义(t=3.583，P<0.05)；转染miR-613+pcDNA3-空白组LnCap细胞集落形成数目显著减少，PC3和LnCap细胞增殖明显被抑制，差异有统计学意义(t=3.513，P<0.05)；而在miR-613+pcDNA3-E2F5共转染后，与单独转染miR-613+pcDNA3-空白组相比较，PC3和LnCap细胞集落形成数目有显著提高，差异有统计学意义(t=2.819，P<0.05；t=2.97，P<0.05，图3)。

图2 miR-613对E2F5表达及前列腺癌PC3和LnCap细胞增殖的影响

A、B、C、G、H:PC3细胞E2F5；D、E、F、I、J:LnCap细胞(GAPDH作为内参，*P<0.05，**P<0.01)。

A、B:PC3细胞集落形成结果(0.5%结晶紫,×40)及集落形成率柱状图；C、D:LnCap细胞集落形成结果(0.5%结晶紫,×40)及集落形成率柱状图；1、2、3、4分别代表pcDNA3-空白、miR-613+pcDNA3-空白、miR-613+pcDNA3-E2F5、pcDNA3-E2F5各组(*P<0.05)。

2.4 PC3细胞双荧光素酶报告实验结果在PC3细胞中，用miR-613或Control序列RNA和E2F5 3′-UTR报告质粒共转染后，报告基因的相对荧光素酶活性能够被miR-613明显抑制；但是MUT报告基因的荧光素酶活性没有明显变化(图4)。说明miR-613能够直接靶向E2F5 3′-UTR。

图4 PC3细胞双荧光素酶报告实验验证miR-613和E2F5 3′-UTR结合情况

A：miR-613和E2F5靶基因示意图；B：PC3细胞相对荧光素酶活性强度,*P<0.05。

3 讨 论

前列腺癌目前是影响美国老年男性生活质量的最常见恶性肿瘤，据文献报道，2017年估计新发生前列腺癌患者161 360例，位于男性恶性肿瘤的首位；估计死亡病例约26 730例，占所有男性癌症相关死亡的8%[8]。我国2015年肿瘤数据统计结果显示，前列腺癌的发生率和死亡率有逐年上升的趋势，严重影响我国老年男性健康[9]。miRNA是一类能影响基因表达的关键转录后调节因子，作为癌基因或者肿瘤抑制因子在前列腺癌的发生、发展中发挥作用，并且在前列腺癌的诊断、治疗和预后中也有重要的作用[10]。在此次研究中，我们先通过检测我院在2016年10月至2017年10月期间收集到的前列腺癌组织标本中miRNAs的表达差异，进而发现miR-613在前列腺癌组织中表达明显降低。同时，我们也检测了几种常见的前列腺癌细胞系中miR-613的表达情况，结果证实miR-613在前列腺癌细胞系中表达也降低。miRNA-613与癌症发展密切，越来越多的证据表明，miR-613在多种肿瘤中表达下调，包括乳腺癌、肝癌、结肠癌和膀胱癌等在内，并抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等多种生物学过程，发挥抑癌作用[5-6,11-12]，REN等[7]研究发现，miRNA-613能够通过靶向Frizzled7抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭。

E2F5是E2F家族蛋白中的重要成员，能够与参与细胞周期调控的靶基因启动子结合，从而调控这些靶基因的表达[13]。已经有研究结果表明，E2F家族蛋白能够通过调节参与细胞周期过程的基因表达，进而影响细胞生长和增殖[14]。据报道，在包括食管鳞状细胞癌、肝癌和结直肠癌在内的多种肿瘤中E2F5基因表达明显上调，并可能作为一种独立的预后因素[15-17]，表明E2F5可能是一种癌基因，与肿瘤发生及侵袭转移的特性关系密切。而且有研究表明，E2F家族蛋白在调控细胞周期中起关键作用，特别是能够调节细胞周期G0/G1转换[18-19]。有一项研究结果提供了令人信服的证据，证明E2F5和c-myc的同时拷贝数增加与前列腺癌的发生和发展有关[20]。尽管E2F5蛋白传统上被认为是转录抑制因子，但在不同癌症中观察到的结果表明E2F5蛋白的增加只可能具有致癌作用。MAJUMDER等[21]的研究结果表明，E2F5/p38轴能够通过pSMAD3L激活前列腺癌中的细胞增殖，E2F5具有作为前列腺癌早期检测工具的潜力。

因此，本实验通过在PC3细胞中过表达miR-613检测E2F5信使和蛋白的表达情况，同时探究对前列腺癌细胞系PC3及LnCap细胞增殖的影响，结果表明，过表达miR-613能够抑制PC3、LnCap细胞的增殖，且是通过抑制E2F5的表达机制发挥作用。双荧光素酶报告实验结果表明，miR-613也能够通过与E2F5基因3′-UTR部分碱基序列互补而相互结合，靶向调节E2F5的表达；过表达miR-613后，E2F5基因在信使和蛋白水平表达均受抑制。此外，E2F5已被确定为几种miRNA的靶基因，包括miR-34a[17]，miR-132[22]，miR-154[23-24]，和miRNA-1-3p[25]，调节肿瘤的侵袭、转移和增殖等过程。我们后续实验将会进一步研究和验证该过程中是否有表观遗传的参与和调节，以期能够明确其作用机制，并为前列腺癌的治疗提供理论基础和新思路。