槲皮素对免疫低下小鼠免疫功能的影响

田瑞雪 孙耀宗 姚有昊 张子健 张继民 宋维芳

免疫系统作为机体十分重要的系统发挥着免疫防御、免疫监视及免疫自稳的作用。环磷酰胺作为临床常用的抗肿瘤化疗药，在抗肿瘤的同时会广泛杀伤免疫细胞造成机体免疫低下，因此实验中常被用来制造小鼠免疫低下模型[1，2]。当免疫力低下时，机体不能及时清除衰老损伤突变细胞，不能及时清除入侵的病原体，导致肿瘤和感染的发生。因此提高机体免疫功能对于维持机体健康、抵御疾病具有重要意义，尤其是对化疗后造成免疫低下的患者意义重大。

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，其化学名为 3'，4'，3，5，7-五羟基黄酮，广泛存在于许多植物的花、叶、果实中。槲皮素具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤等多方面的药理作用[3～6]。有研究表明槲皮素可以促进正常小鼠T 细胞亚群分化，也可通过抑制病理性CD4+T 细胞治疗自身免疫性心肌炎[7]，对免疫细胞具有双相调节作用[8]。Singh 等[9]研究发现槲皮素可以增强免疫低下小鼠Th2 细胞免疫。另有研究表明，黄酮类化合物可以促进免疫细胞增殖，增强机体免疫力[10～12]。Fan 等[13]研究发现，龙血竭总黄酮对免疫低下小鼠有免疫调节作用。Wu等[14]研究发现，淫羊藿总黄酮对正常小鼠有免疫促进功能。槲皮素作为一种重要的黄酮类化合物，是否对小鼠免疫功能具有调节作用，尤其是对免疫低下小鼠模型的作用未见报道。本实验通过对环磷酰胺致免疫低下的小鼠外周血白细胞计数，免疫器官指数，T、B 细胞增殖功能，巨噬细胞吞噬能力，CD4比例及CD4/CD8 比值，脾淋巴细胞凋亡率检测来探讨槲皮素对免疫低下小鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 流式细胞仪，BECKMAN，美国；Eppendorf 微量移液器，德国；酶标仪，MD，美国；显微镜，Leica，德 国；anti-mouse CD4 PE-Cy5、anti-mouse CD8a PE、为美国eBioscience 公司产品；AnnexinVFITC/PI 细胞凋亡试剂盒为北京四正柏生物公司产品；槲皮素（Quercetin，Que）购自上海生工生物公司；注射用环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）购自江苏盛迪医药有限公司（批号：17032125）；3-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide，MTT）购自北京索莱宝公司；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（ConA）为美国 Sigma 公司产品。

1.2 实验分组 雄性 C57BL/6 小鼠30 只，6 周龄，体重（20±2）g，购自山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（晋）2015-0001，合格证号：NO.16697。小鼠随机分为正常对照组、CTX 组、Que 组，每组10 只。正常对照组、CTX 组小鼠灌胃NS（每日0.2ml/只），参照文献[15]，Que 组小鼠灌胃Que 80mg/kg（每日0.2ml/只），连续灌胃20 天。第16 天，除正常对照组外其余两组小鼠连续3 天腹腔注射CTX 50mg/kg。

1.3 观察指标及检测方法 小鼠眼球采血20μl，加入 380μl 白细胞稀释液（2%的冰醋酸）中，吹打均匀，改良牛鲍计数板充池进行白细胞计数。

小鼠称重记录后处死，解剖取胸腺、脾脏，电子秤称重。计算胸腺指数和脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量（mg）/小鼠体质量（g）×10；胸腺指数=胸腺质量（mg）/小鼠体质量（g）×10。

收集小鼠脾细胞，调脾细胞浓度为1×105/ml，取100μl 于96 孔板，分别加入含ConA（终浓度为 5μg/ml）和LPS（终浓度为10μg/ml）的RPMI1640培养液100μl（设3 个复孔），同时设阴性对照，细胞培养72h 后加MTT（5mg/ml）20μl/孔，继续培养 4h，离心培养板，弃上清，加二甲基亚砜150μl/孔，振荡，570nm 测OD 值，检测T、B 细胞增殖功能结果以刺激指数表示。刺激指数（SI）=刺激孔（加 ConA 或LPS）OD 值/对照孔OD 值。

末次给药前两天，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉溶液2ml，隔日处死小鼠，腹壁开小孔，生理盐水反复吹吸收集腹腔悬液，离心收集细胞，6 孔板贴壁 3h，收集贴壁细胞，RPMI1640 培养基调整细胞数为1×105/ml。取100μl 于96 孔细胞培养板中孵育3h（设3 个复孔），弃上清，加0.1%的中性红溶液200μl/孔，继续孵育30min，弃上清后PBS 洗涤2次，加细胞解液（乙醇∶乙酸=1∶1）200μl/孔，过夜，490nm 测OD 值，检测巨噬细胞吞噬功能。

收集小鼠脾细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，取100μl 加CD4 和CD8a 荧光抗体孵育0.5h，PBS 洗涤后200μl PBS 重悬，流式细胞仪检测CD4 比例及CD4/CD8 比值。取100μl 细胞加Binding buffer 100μl，加入5μl Annexin-V 和10μl PI 染色，流式细胞仪检测脾淋巴细胞凋亡。

1.4 统计学方法 采用统计学软件SPSS 17.0 分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验和方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白细胞计数及免疫器官指数 白细胞计数及免疫器官指数检测结果显示，与CTX 组相比，Que 组的外周血白细胞计数、体重及脾脏指数均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组相比，Que 组的外周血白细胞计数、体重及胸腺指数均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 T、B 细胞增殖及巨噬细胞吞噬结果 MTT 法检测脾淋巴细胞增殖结果显示，与CTX 组相比，Que 组的T 细胞增殖指数增加，差异有统计学意义（P＜0.05），B 细胞增殖指数及巨噬细胞吞噬功能则无显著差异。与正常对照组相比，Que 组的T 细胞和B 细胞增殖指数及巨噬细胞吞噬功能差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 各组小鼠白细胞计数及免疫器官指数检测结果（±s，n=10）

表1 各组小鼠白细胞计数及免疫器官指数检测结果（±s，n=10）

注：与正常对照组相比，aP＜0.05；与CTX 组相比，bP＜0.05

组别 白细胞计数（×109/L） 体重（g） 胸腺指数 脾脏指数正常对照组 9.90±1.26 22.51±1.90 31.01±5.38 31.16±3.12 CTX 组 4.27±0.57a 17.44±0.53a 19.16±4.23a 20.60±3.58a Que 组 6.94±2.19ab 19.92±1.49ab 23.15±6.72a 27.42±7.02b

表2 T、B 细胞增殖及巨噬细胞吞噬结果（±s，n=10）

表2 T、B 细胞增殖及巨噬细胞吞噬结果（±s，n=10）

注：与CTX 组相比，aP＜0.05；与正常对照组相比，bP＜0.05

组别 T 细胞（SI） B 细胞（SI） Mac（OD490nm）正常对照组 1.48±0.38 1.52±0.21 0.31±0.12 CTX 组 1.08±0.08b 1.03±0.14b 0.15±0.43b Que 组 1.37±0.12a 1.36±0.39 0.25±0.11

2.3 CD4，CD8 及CD4/CD8 检测结果 流式细胞术检测脾淋巴细胞CD4、CD8 结果显示，与CTX 组相比，Que 组的CD4 细胞比例及CD4/CD8 比值增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组相比，Que 组的CD4 细胞比例及CD4/CD8 比值降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 CD4，CD8，CD4/CD8 检测结果（%，n=10）

2.4 脾淋巴细胞凋亡结果 流式细胞术Annexin-V和PI 双染法检测脾淋巴细胞凋亡结果显示，正常对照组凋亡细胞比例为（0.76±1.1）%，CTX 组为（12.1±2.2）%，Que 组为（9.1±1.7）%。与CTX 组相比，Que 组的脾淋巴细胞凋亡比例降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组相比，Que 组的脾淋巴细胞凋亡比例升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组相比，CTX 组比例升高（P＜0.05）。

3 讨论

胸腺和脾脏是重要的外周免疫器官。胸腺是T 淋巴细胞分化成熟的主要场所，胸腺刺激T 淋巴细胞后成为具有免疫活性的T 淋巴细胞，主要参与细胞免疫。脾脏含有T 淋巴细胞和B 淋巴细胞，是浆细胞分化产生抗体、淋巴细胞迁移和接受抗原刺激后发生免疫应答的重要场所，参与细胞免疫和体液免疫。CD4 比例及CD4/CD8 比值可以反映机体免疫状况，当肿瘤及免疫低下发生时，CD4 比例及 CD4/CD8 比值降低，当自身免疫病发生时CD4 比例及CD4/CD8 比值升高。巨噬细胞吞噬功能也能较好地反映机体免疫状态。机体免疫功能低下时也会出现淋巴细胞增殖功能降低，凋亡增加。故本实验选择检测白细胞数量、免疫器官指数、脾淋巴细胞增殖率、巨噬细胞吞噬功能、CD4 比例及CD4/CD8比值及淋巴细胞凋亡率来反映免疫功能情况。

CTX 作为抗代谢促凋亡化疗药已经广泛用于各种肿瘤的治疗中，但其在杀伤肿瘤细胞的同时会广泛杀伤正常的免疫细胞，造成严重的免疫抑制，患者继发免疫紊乱及感染，严重者危及生命。联合其他药物使用，杀伤肿瘤细胞的同时减轻免疫抑制等严重的副作用是肿瘤临床治疗亟待解决的问题。Que是一种黄酮类化合物，广泛存在于瓜果蔬菜中。已有各种研究表明，槲皮素具有促进免疫细胞增殖、增强免疫力的作用。本研究采用50mg/kg CTX 连续3 天腹腔注射建立小鼠免疫低下模型。研究结果显示CTX 可显著降低小鼠外周血白细胞数量，降低胸腺及脾指数；降低T、B 细胞增殖指数；降低巨噬细胞吞噬能力；降低脾淋巴细胞CD4 比例及CD4/CD8 比值；促进淋巴细胞凋亡，表明采用50mg/kg CTX 连续3 天腹腔注射可建立免疫低下小鼠模型，该结果与 CTX 抗代谢促凋亡的药理作用一致。80mg/kg Que灌胃治疗后可显著升高外周血白细胞数量、胸腺及脾指数；升高脾淋巴细胞CD4 比例及CD4/CD8 比值；促进T、B 细胞增殖；提高巨噬细胞吞噬功能；降低淋巴细胞凋亡比率，有效改善小鼠免疫低下状态。

由于Que 生物利用度低、水溶性差、代谢速度快及酶促降解等问题，动物体内研究其抗炎及抗肿瘤功效时均发现小剂量效果低于中剂量甚至没有效果[16]，因此本实验采用大多数实验使用的80mg/kg 的中剂量，高剂量Que 的疗效有待进一步研究。近年来，与Que 羟基反应生成醚和酯、羰基氧的取代、与金属形成配合物等槲皮素衍生物的出现，为Que 生物利用度低这一问题提供了较好的解决方案。