PcDNA3.1（+）/CYP11B2真核表达质粒的构建及其在NCI-H295R细胞中的表达

蔡辉 黄文利 孙朝辉

原发性醛固酮增多症是以醛固酮分泌增多和血管紧张素原-肾素系统受抑制为表现的综合征。其主要的病理特点为高血压、血钾水平紊乱和进行性的靶器官损害。主要原因是特发性双侧肾上腺增生（IHA）和肾上腺肿瘤[主要表现为良性肾上腺皮质瘤，其次为单侧肾上腺增生和家族性醛固酮增多症（GRA）]。GRA 是一种单基因性高血压，并且是目前唯一的一种分子机制被弄清楚的PA[1]。原发性醛固酮增多症（原醛症）也是继发性高血压最常见的原因，既往认为是一罕见的疾病，但随着对此病的认识和检查手段的普及，其发病率也逐渐增高。目前很多研究都集中在揭露原醛症的分子遗传机制，有报道醛固酮合成酶基因（CYP11B2）多态性与原发性高血压、左室肥厚和心肌梗死有关[2～4]。体外定点突变分析显示，醛固酮合成酶的第288 位甘基酸和第320 位丙基酸分别对该酶的18-羟化酶活性和18-氧化活性具有非常关键的作用[5]。D147E 突变会使醛固酮合成增多[6]，而在皮质酮甲基氧化酶缺乏的患者中发现很多突变会使醛固酮合成减少[7，8]。在国外SNP 数据库中发现该基因编码区有多种错义突变，而这些突变很有可能会导致蛋白质功能改变。本研究在体外克隆出人的醛固酮合成酶基因构建真核表达载体，并在NCI-H295R 细胞中表达，为下一步的突变分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒 菌株E.coli DH5α和PcDNA3.1（+）由本实验室保存（来自美国Stratagene 公司），其中PcDNA3.1（+）含CMV 启动子和新霉素（Neomycin） 抗性基因。PMD18-T 载体购自大连宝生物公司。

1.1.2 主要试剂 RNA 提取试剂—阳离子脂质体Lipofectamine™ 2000 购自Invitrogen 公司；逆转录试剂盒购自TOYOBO 公司；凝胶回收试剂盒、限制酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ、T4DNA 连接酶、PCR 反应试剂盒购自大连宝生物公司；去内毒素质粒提取试剂盒和D2000Marker、100bpMarker 购自天根生物公司；胰蛋白酶（Trypsin）购自Gibco 公司；醛固酮放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所；NCIH295R 细胞（人肾上腺上皮细胞）为本实验室保存（来自ATCC）；培养H295R 细胞用的DMEM/F12 培养基（包含365mg/ml L-glutamine和15mM Hepes）购自Gibco 公司；1%ITS（由胰岛素、转铁蛋白和硒组成的混合物）和2%Nuserum 购自Soprachem 公司；凝胶成像系统（Gene Genius Bio Imaging System）为Synegene 公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 PCR 引物 参照GenBank 上公布的序列（登录号：D13752），应用Primer 5.0 和 oligo6.0 软件设计引物：上游P1：5'-CGGAAGCTTGGAGCACTC AGG-3'，下游P2：5'-CTGGAATTCAGTTAATCGCTC TGAAAGTGAGG-3'，上下游划线部分分别为Hind Ⅲ和EcoRⅠ的酶切位点，上游粗体部分为KOZAK 序列，斜体部分为保护碱基，方框内为起始密码。

1.2 方法

1.2.1 逆转录-聚合酶反应扩增 用RNA 提取试剂从人的肾上腺组织中提取总的RNA（具体操作按照说明书进行）。逆转录反应条件如下：65℃ 5min，立即置冰上冷却；30℃ 10min，42℃ 60min，99℃ 5min，4℃保存。逆转录反应体系20μl：RNase Free H2O 8μl，Random Primer 1μl，RNA 3μl，5×RT Buffer 4μl，10mM dNTPs 2μl，Rnase inhibitor 1μl，Rever TraAce 1μl。

以cDNA 为模板，特异性上下游引物通过PCR扩增目的基因。反应体系50μl：去离子水36.5μl，10×probest bufferⅡ5μl，2.5mM dNTP 4μl，上下游引物各1μl，probest 高保真 酶0.5μl，cDNA 模板3μl。PCR 反应条件：采用Touchdown 程序实现特异扩增，94℃ 5min，94℃ 30s，从68℃开始，每2度递减1 次，直到60℃，共5 个温度（68℃、66℃、64℃、62℃、60℃）。每个温度2 个循环，共10 个循环。最后以58℃循环25 次。每个循环的条件是变性30s，退火30s，延伸1min 45s，循环结束后以72℃延伸5min，4℃保存。

PCR 程序如下：

最后反应产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，确认目的条带约在1 500bp 左右，并割下目的条带。

1.2.2 目的基因克隆 用晶美生物公司的凝胶纯化回收试剂盒将PCR 产物纯化回收（具体操作按照试剂盒说明书进行）。将目的基因与T 载体按照比例16℃连接过夜，重组质粒转化DH5 大肠杆菌，将转化后的DH5α 涂布于含100mg/L 氨苄青霉素的LB平板上37℃培养12～16h 后，挑取菌落于试管中小量扩增过夜，通过菌液PCR 和双酶切初步鉴定为阳性克隆后送往北京奥科公司测序。

1.2.3 目的基因真核表达质粒的构建 从测序鉴定正确的重组体中提取质粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制酶将目的基因从T 载体上酶切下来，将目的基因纯化回收后与用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切的PcDNA3.1（+）连接，重组质粒转化DH5 大肠杆菌，37℃培养12～16h，从含氨苄青霉素的LB 平板上随机挑取菌落。通过菌液PCR 和双酶切初步鉴定。

1.2.4 目的基因序列测定 将初步鉴定为阳性克隆的重组体送往北京奥科公司双向测序。通过Blast，DNAMAN 软件对核苷酸序列和氨基酸序列与GenBank 上的参考序列进行同源性比对。

1.2.5 转染用的质粒DNA 的制备 纯化以去内毒素质粒提取试剂盒，分别提取质粒PcDNA3.1（+）和PcDNA3.1/P450Aldo。经分光光度计和电泳检测，A260/A280＞1.8，且无任何降解的DNA 用于转染。

1.2.6 细胞转染用 含1% ITS 和2%Nuserum 的DMEM/F12 培养液在37℃、5%CO2 的 培养箱 中培养H295R 细胞。利用脂质体法，将表达载体PcDNA3.1/P450Aldo 导入细胞中，对照组用空载体PcDNA3.1 转染。6 孔板中的细胞生长达80%融合时弃培养液，加入OPTI-MEMI 培养液500μl，将4μg DNA 和10μl lipofectamine 2 000 分别加入250μl OPTI-MEMI 中，5min 后将两者混合，室温放置25min 后加入培养液，空白组加入等体积的OPTI-MEMI。培养箱中放置5h 后更换细胞培养液，转染48h 后收获细胞，并取细胞培养液作为放射免疫法（RIA）检测醛固酮样品。

1.2.7 RT-PCR 检测CYP11B2 mRNA 的表达 转染48h 后收获细胞，提取RNA 后进行逆转录反应获得cDNA，最后以CYP11B2 基因特异性引物进行扩增并以GAPDH 做内参。

1.2.8 细胞上清醛固酮的检测 使用北京北方生物技术研究所的醛固酮放射免疫分析试剂盒对细胞上清进行醛固酮检测，具体实验步骤按照试剂盒说明书检测。

1.2.9 统计学方法 所有数据均用±s表示，使用统计软件SPSS 20.0 进行方差分析。

2 结果

2.1 从肾上腺组织中RT-PCR 扩增目的基因 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实产物约为 1 535bp，如图1所示。

图1 CYP11B2 基因扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳

2.2 目的基因真核表达质粒的构建及重组体的鉴定菌液PCR 扩增可见约1 535bp 左右大小的片段，如图2所示。将菌液PCR 初步鉴定为阳性的质粒用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，可见两条条带，一条约 5 400bp，为PcDNA3.1（+），一条约1 535bp 为目的条带。如图3所示。

图2 菌液PCR 产物的1%琼脂糖凝胶电泳

2.3 目的基因序列测定 真核表达质粒的目的基因全长有1 509bp，编码503 个氨基酸。通过Blast，DNAMAN 软件对核苷酸序列和氨基酸序列与GenBank 上的参考序列进行同源性比对，有1 个核苷酸改变（A3323G），1 个氨基酸改变（K173R），核苷酸序列同源性为99.9%，氨基酸序列的同源性为99.8%。

2.4 转染后RT-PCR 检测CYP11B2 mRNA 的表达可以看到重组质粒PcDNA3.1/P450Aldo转染细胞组，空载体PcDNA3.1（+）转染组和未经任何质粒处理的细胞组（空白组）在1 535bp 左右处均出现一条特异性的扩增带，与P450Aldo cDNA 编码区的大小相符。但空载体组和空白组的条带明显较转染重组质粒PcDNA3.1/P450Aldo 组弱，如图4所示。

图4 三组CYP11B2mRNA 的表达

2.5 细胞上清中醛固酮的检测 空载体组和空白组分别为（2.68±0.56）μg/ml 和（2.83±0.49）μg/ml，PcDNA3.1/P450Aldo 转染组为（8.61±0.75）μg/ml，明显高于前面两组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

存在于基因编码序列中的SNP，称为编码SNP（coding SNPs，cSNPs）。人类基因组共有25～40 万个cSNP。其中20%～30%能引起氨基酸的编码序列发生改变，导致蛋白质功能变化。分析改变氨基酸的cSNP 成为研究基因及蛋白质功能的方法之一[9]。

醛固酮是人体内重要的盐皮质激素，除了保钠排钾可以引起水钠潴留外，还可以刺激钠通道蛋白、胶原蛋白合成增多，促进胶原合成沉积，使心脏、血管以及其他器官纤维化和结构重塑，在高血压、心力衰竭及心脑血管疾病发生、发展中起着重要作用[10]。

合成醛固酮的关键酶醛固酮合成酶的编码基因为CYP11B2。在CYP11B2 基因启动子区- 344T/C 多态性的研究中，发现不同基因型人群的醛固酮浓度不同，并且该多态性与高血压、缺血性心脏病、小动脉顺应性相关[2～4]。在编码区中也存在几十种多态性，其中约有11 种错义突变。有些错义突变点位于酶活性作用发挥的关键部位，比如底物结合部位或是血红素结合域等。这些SNP 有待于进一步研究其功能变化。因此，本实验体外克隆了人的CYP11B2 基因并构建出真核表达载体为今后的定点突变分析奠定了基础。

由于CYP11B2 基因和CYP11B1 基因（编码类固醇羟化酶）外显子有95%的同源性[1]，我们在认真比对这两个基因5'末端和3'末端后在差异明显处设计引物，并且为了以后亚克隆和表达需要分别设计了酶切位点和柯萨克（KOZRK）序列。从肾上腺组织中提取总的RNA，经逆转录获取cDNA 后，扩增出了目的基因。在实验中我们通过选用高保真的Probest 酶并采用特异性强的TouchDown PCR 对目的基因片段进行扩增，以及利用重组载体转化大肠杆菌后进行克隆筛选、测序鉴定等方法确保了该重组载体能正确编码P450Aldo 蛋白的氨基酸序列。

表达载体的构建是在细菌质粒上引入一个真核启动子，在启动子的下游插入目的编码基因，其后有poly A 和转录终止序列，即在一个真核表达质粒上克隆进某种编码基因的cDNA 序列。构建真核表达载体时，载体启动子类型直接影响质粒DNA 在体内表达外源蛋白水平，最常用的启动子来源于人巨细胞病毒（hCMV），其可在多种细胞中诱导强而有效的表达[11]。PcDNA3.1（+）真核表达载体即采用该启动子。此载体中含真核表达组件，f1 噬菌体的复制起始区用于大肠杆菌内单链的合成，pMB1复制起始子用于在大肠杆菌内的复制，SV40 复制起始区用于在哺乳动物细胞内复制。PcDNA3.1 的聚苷酸化信号来源于牛生长激素，可提高克隆基因的稳定性及翻译效率，促进有效表达[12]。多克隆位点两侧有T4 噬菌体启动子，使插入的外源DNA 在每一条链都能进行体外转录，表达由CMV 早期启动子启动。由于质粒上不仅有大肠杆菌的复制起点，而且有真核启动子，所以表达载体既能在原核细胞中复制，又可在真核细胞表达。质粒经过在细菌中扩增，提取和纯化就可以直接用于转染实验。

本实验结果显示克隆的CYP11B2 基因全长 1 509bp，编码由503 个氨基酸组成的蛋白质，其相对分子质量为48.5KD。重组真核表达质粒的目的基因测序结果与GenBank 上公布的序列比较有1个核苷酸差异，相对于起始密码子ATG 的第518 位由A →G，基因序列同源性为99.8%。这个核苷酸差异引起第173 位的氨基酸改变，即K 赖氨酸→R精氨酸，蛋白质序列同源性为99.9%。与国外SNP数据库比较，这个核苷酸变异是一个多态性位点，编号为rs4539。体外功能分析显示这个多态性位点K173R 对醛固酮合成酶的活性无影响，与原醛症及原发高血压无明显相关[13]。但为了保证下一步定点突变结果的可靠性，我们设计两条定点突变引物5'-GGT TGC TGG CTT CTA TGG TGT AGT GGA AG-3' 和5'-CTC CCA GGC CCT GAA GAA GAA GGT G-3'，采用重叠PCR 技术将173 位的精氨酸突变成赖氨酸。将测序结果与参考序列比对，结果完全一致，核苷酸序列同源性为100%，未引入其它突变位点。

在体外表达实验中，我们采用了阳离子脂质体转染方法，Lipofectamine™ 2000 转染效率高，操作简单方便。所选用的宿主细胞为肾上腺上皮细胞NCI-H295R，来源于非侵袭性的肾上腺皮质肿瘤，它是第一种也是唯一的人类肾上腺皮质细胞，能够产生和分泌三种肾上腺皮质激素—糖皮质激素、盐皮质激素和雄激素，可以很好地用于人类类固醇激素生成的研究[14]。转染后经RT-PCR 和放免法检测醛固酮可以看到三组均可见目的条带以及醛固酮的生成，这是因为细胞本身含有合成类固醇激素的关键酶，但转染组与空白组和空载体组相比，条带亮度明显增强，醛固酮的量也显著增多，说明重组质粒能够在细胞中表达。

PcDNA3.1/P450Aldo 真核表达质粒的成功构建，为下一步定点突变分析奠定了实验基础。