禽沙门氏菌鉴别培养基和PCR检测方法的建立

张富友 宋艳 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孙淑红

禽沙门氏菌鉴别培养基和PCR检测方法的建立

张富友 宋艳 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孙淑红*

（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271018）

禽沙门氏菌是常见的一种人畜共患病原菌，快速准确地检测对于防控沙门氏菌病非常重要。传统的沙门氏菌检测方法准确，但操作繁琐、费时费力。本研究拟建立准确快速的检测技术。选择疑似发生沙门氏菌病的某种鸡群3个批次共计119份未出壳死胚样品，分别经BPW增菌，SC和TTB分别增菌后，再利用XLD鉴别培养基培养后，利用PCR方法进行沙门氏菌的分离鉴定。同时，所有样品均按照国家标准检测方法(国标法)进行沙门氏菌的分离鉴定。结果显示，本研究建立的沙门氏菌快速检测方法与国标法相比，沙门氏菌检出率均为41.2%，吻合率100%；血清分型试验显示，该49株沙门氏菌均为鸡白痢沙门氏菌；本研究建立的检测方法用时3d-6d，而国家标准检测方法需要6d-9d。本研究表明，禽沙门氏菌鉴别培养基和PCR检测技术可准确、快速地完成沙门氏菌的检测，而且成本更低。该技术方法可用于种鸡群沙门菌感染状态评估和调查分析以及规模化种禽场沙门菌净化，对生产实践具有重要的指导意义。

禽沙门氏菌 鉴别培养 国家标准 PCR

禽沙门氏菌病是由不同血清型的沙门氏菌引起的禽类不同类型传染病的总称，根据病原体的抗原结构不同可以分为鸡白痢、禽伤寒和禽副伤寒[1]。禽沙门氏菌在世界各地普遍存在，对养禽业危害很大[2]。同时，部分血清型的沙门氏菌是人畜共患病原菌，防控禽沙门氏菌病对公共卫生有重要意义[3]。

目前国家标准检测方法(国标法)是用于禽沙门氏菌分离鉴定最常用的方法，该标准可保证检测结果的准确性，但是在疾病预防和疫情的应急处理中不能够适用。免疫学检测方法相比传统方法省时，灵敏度高，但大部分依赖设备，且对技术人员有一定的要求[4]。本研究拟简化传统方法，把鉴别培养和PCR方法结合，既保证检测结果的准确和灵敏，又操作简单易行，建立适用于禽沙门氏菌快速鉴定的检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料来源 山东省某种鸡群疑似发生沙门氏菌病，采集三个批次的未出壳死胚送检，共计119份。

1.2 试剂 缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(TTB)、碘液、0.1%煌绿、XLT4琼脂、亚硫酸铋琼脂(BS)均购自青岛海博生物技术有限公司；2×Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；沙门氏菌生化鉴定管(GB)购自杭州微生物试剂有限公司；沙门菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。

1.3 增菌培养 按照GB 4789.4-2016规定进行增菌培养。无菌取鸡胚肝脏、部分肠段样品，剪碎，加入BPW预增菌，37℃、220rpm/min培养8~ 18h；然后分别用SC培养基和TTB培养基培养，37℃、220rpm/min培养18~24h。

1.4 本研究建立的禽沙门氏菌鉴别培养基和PCR检测方法

1.4.1 鉴别培养 取1.3增菌培养后样品用三线法接种到XLD鉴别培养基，37℃培养18~48h。

1.4.2 PCR鉴定 按照参考文献[5]合成沙门氏菌通用引物FimW，由睿博兴科生物技术有限公司合成(引物见表1)，优化其PCR反应程序[6]。从XLD培养基上分别挑取4~6个可疑菌落，接种到LB培养基中培养，然后用培养后的增菌液作为模板，进行PCR方法检测。

表1 FimW引物序列及片段大小

1.5 禽沙门氏菌检测的国标法 取1.3增菌培养后的样品，按照GB 4789.4-2016规定进行鉴别培养、生化试验等检测。

1.6 沙门氏菌分离株的血清型鉴定 按照沙门菌属诊断血清试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 禽沙门氏菌的鉴别培养基和PCR检测方法的检测结果

2.1.1 疑似沙门氏菌的菌落形态 SC和TTB选择性增菌培养后，经XLD鉴别培养基培养后发现，119样品中有49样品出现无色半透明菌落，疑似鸡白痢沙门氏菌(图1)。SC+XLD和TTB+XLD组合中可疑菌落比例分别为49/119和45/119。

图1 疑似鸡白痢沙门氏菌的菌落形态

2.1.2 PCR鉴定结果 用FimW引物进行PCR鉴定结果表明，49株疑似沙门氏菌样品均检测为阳性（图2）。

图2 部分样品的PCR检测结果

2.2 禽沙门氏菌的国标法检测结果

2.2.1 疑似沙门氏菌的菌落形态 SC和TTB选择性增菌培养后，经XLD和BS鉴别培养基培养发现，119样品中，XLD培养基中出现无色半透明菌落，BS培养基上出现黑色或灰色有金属光泽的菌落，SC+XLD、SC+BS、TTB+XLD和TTB+BS 4个组合中疑似鸡白痢沙门氏菌感染的比例分别为49/119、11/119、45/119和15/119国标法共分离到49株疑似沙门氏菌菌株。

2.2.2 生化试验结果 从2.2.1中4个组合的XLD和BS培养基上分别挑取2个以上可疑菌落进行生化试验鉴定，结果表明，大部分样品三糖铁琼脂斜面呈红色(产碱)，底层呈黄色(产酸)，部分样品产气，没有样品产H2S，大部分样品赖氨酸呈紫红色(阳性)，少数呈黄色(阴性)，全部样品蛋白胨水、尿素、氯化氢呈阴性，为A3反应，需要补做ONPG。ONPG结果全部为阴性，表明该种鸡群分离鉴定的49株可疑菌株全部为沙门氏菌。

2.3 禽沙门氏菌分离株的血清型鉴定结果

血清分型试验显示，49株沙门氏菌O9；O12抗原凝集，为D群沙门氏菌；半固体培养基穿刺结果表明，全部菌株没有生长出鞭毛；结果表明，全部沙门氏菌为鸡白痢沙门氏菌。

3 讨论

3.1 两种检验方法的耗时比较

本研究建立的方法是通过前增菌、增菌、划线培养、菌液PCR和血清学试验，耗时约3~6d，可一人独立完成；国标检测通过前增菌、增菌、划线培养、生化试验和血清学试验，耗时约6~9d时间，但是生化试验需要两人操作(一人独立完成需增加1d)。生产中如果只针对沙门氏菌阳性率检验，可以省去血清学试验，实验室方法大约使用3d左右的时间，国标法则大约需要6d。综上所述，本研究建立的方法更省时。

3.2 灵敏度、特异性的比较

实验室建立的方法共分到49株沙门菌，国标法(GB 4789.4-2016)共分到49株沙门菌，二者沙门氏菌分离率一致，无差异。

3.3 资金费用的比较

本研究建立的检测技术更经济实惠。仅用XLD培养基完成鉴别培养[6]，而国标法中应用XLD和BS两种鉴别培养基；同时，用优化的PCR方法代替了国标法的耗时费力且成本高的生化试验。

3.4 操作便捷的比较

前期试验证明，XLD培养基对禽沙门氏菌分离效果比BS培养基好，并且分离株包含BS培养基中分离到的菌株、XLD培养基可以取代BS培养基来实现禽沙门氏菌的分离鉴定。PCR方法更便捷，优于生化试验。两种方法中前增菌、增菌工作相同；PCR检测需要用菌落或菌液做模板，PCR反应完成后琼脂糖凝胶电泳；而生化试验则需要准备三糖铁斜面、营养琼脂平板，操作过程中每个样品需要依次经过三糖铁斜面划线和穿刺、接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂，同时需要接种蛋白胨水、尿素琼脂和氰化钾培养基，然后根据初步判断结果，判断是否需要补做后续试验，该操作过程非常繁琐，需要两个人共同完成，中间容易出差错。

综上所述，本研究建立的禽沙门氏菌鉴别培养基和PCR检测方法优于国标法，具有准确快速、操作方便等优点，可作为沙门菌感染状态评估和调查分析以及规模化种禽场沙门菌净化所需的检测技术。

[1] 初莉莉. 鸡沙门氏菌病的防治[J]. 兽医导刊, 2017(3).

[2] 张众. 一例由禽沙门氏菌引起的雏鸡疾病诊治[J]. 畜牧兽医科技信息, 2017(11): 113-113.

[3] 华玉新. 肉仔鸡沙门氏菌的分离鉴定与防治[J]. 兽医导刊, 2017(22):124-125.

[4] 赵春阳, 江强世, 刘畅等. 沙门氏菌检测方法研究进展[J]. 中国奶牛, 2018(10): 27-31.

[5] 张江英, 董立伟, 王小舟等. 针对fimW基因沙门菌的特异性PCR检测[J]. 中国预防兽医学报, 2013, 35(10): 837-839.

[6] 张富友, 宋艳, 崔治中等. 禽沙门菌分离鉴定方法的建立与优化[J]. 山东畜牧兽医, 2019, 40(8): 1-4.

（2019–09–29）

国家十三五重点研发计划项目（2016YFD0501608）；山东省农业重大应用技术创新项目（SD2019XM009）

S852.61+2

A

1007-1733(2019)10-0001-03