延边黄牛和韩延牛血液外胞体中miRNA的差异表达分析

娄安钢 杨咏洁 金太花 张睿 崔成都 于龙政 关立增

延边黄牛和韩延牛血液外胞体中miRNA的差异表达分析

娄安钢①杨咏洁①金太花②张睿①崔成都①于龙政①关立增①②*

（①延边大学农学院 吉林延吉 133002 ②临沂大学农林科学学院 山东临沂）

为进一步探讨Exosome中miRNA对延边黄牛和韩延牛生长发育的分子调控差异。本研究从延边黄牛和韩延牛血液Exosome中分离出miRNA，通过RNASEQ测序和生物信息学技术分析了延边黄牛及韩延牛血液Exosome中miRNA的表达特点。结果表明，在延边黄牛和韩延牛血液Exosome中获得差异表达miRNA有524个，其中上调表达的271个，下调表达的253个，其中已知miRNA 382个，新miRNA 142个；差异表达miRNA的靶基因预测结果说明，在两个品种牛中共预测到 52348个靶基因。GO富集分析可知，这些靶基因被富集到3473条生物学过程，394条细胞组分以及879条分子功能。KEGG分析可知，这些预测得到的miRNA的靶基因总共被注释到326条信号通路中，其中最显著富集的通路为mTOR信号传导通路。其中显著差异表达的miR-9-5p和miR-99b调控的一些靶基因都与mTOR信号通路有密切的关系。结论：血液Exosome中的miR-9-5p和miR-99b在延边黄牛和韩延牛生长发育差异的过程中可能发挥重要的作用。将为下一步在分子水平上探讨关键差异表miRNA影响边黄牛和韩延牛生长发育差异的分子机制提供试验基础。

延边黄牛 韩延牛 外胞体 miRNA

miRNA是一类长度约为22 nt的非编码的小分子RNA，其可通过靶向降解mRNA 或抑制蛋白的翻译而发挥重要的调控作用[1]。研究发现，miRNA调控着哺乳动物约60%的基因，参与细胞增殖、分化、凋亡、神经形成、肿瘤发生、发展等一系列生物学过程[2]。因此，miRNA是生物体内一类重要的基因调控因子，已经成为国内外生物学研究的热点之一[3]。

外胞体(Exosome)是由细胞分泌的40~200nm的小囊泡[4]。Exosome在不同的生理病理过程中发挥着不同的作用，具有细胞间信息交流及物质传递的功能，可以调节基因表达。研究发现在所有体液中都有Exosome的存在(唾液、母乳、血液、滑液、羊水、尿液、精子和卵泡液等)，通过这些体液Exosome可到达靶细胞，发挥不同的功能[5]。自从2007年Valadi等发现肥大细胞来源的Exosome含有miRNA，并指出Exosome介导的miRNA转移是各类细胞之间交换遗传信息的一种机制后，关于Exosome-miRNA的研究开始不断涌现[6]。研究表明，Exosome中含有大量的miRNA，如Melnik等从牛乳Exosome中发现了miR21、miR29a、miR-29b、miR-155、miR-103及miR-7a、b、c、f等，并证明与代谢有关系[7]。Chen等利用Solexa测序分析技术从猪乳Exosome中检测到491种miRNA，并由生物信息学分析可知，这些 miRNA中的一些参与生物过程，例如转录、细胞分化和增殖，免疫和代谢[8]。但国内外关于Exosome中miRNA的研究主要集中在人与动物的免疫调节作用方面，关于其在动物中的其它生物学功能的报道则较少。而最近的资料证明，Exosome中miRNA对动物的生长调控方面发挥作用，如Melnik等研究发现牛乳Exosome中的miRNA-21可以促进犊牛的生长发育[7]。陈婷等用来源于猪Exosome的miR-PC-86和miR-PC-263处理C2C12细胞，结果显示二者可调控C2C12 细胞上IGF-1R受体的表达，从而对猪肌细胞生长发挥调控的作用[9]。由此表明，Exosome中的一些miRNA 可能与动物生长发育有着密切的关系。基于前人的研究基础，本试验旨在以延边黄牛和韩延牛为研究对象，通过RNA-Seq技术和生物信息学分析技术对延边黄牛和韩延牛血液Exosome中miRNA进行差异表达分析，进而为进一步深入研究miRNA对延边黄牛生长发育调控的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 延边黄牛和韩延牛血液样品 由吉林省龙井市某牛场提供，随机选择延边黄牛和韩延牛各5头，采取血液。

1.2 主要试剂和设备 DEPC、Trizol购自华美生物工程公司；反转录试剂购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司；RNA提取试剂盒(Exosome DNA Extraction Kits)购自美国Illu-mina公司。MDF-U4u863 -80℃冰箱购自日本SAN YO公司；MCO-18AIC三洋二氧化碳培养箱购自日本三洋有限公司；梯度PCR仪购自Eppendorf公司；核酸蛋白测定仪购自美国Thermo公司。

1.3 延边黄牛和韩延牛血液Exosome的提取 通过颈静脉采血方法分别对5头延边黄牛和5头韩延牛采取血液后放入50ml离心管中，以3000rpm离心10min，获得血清，然后将5头延边黄牛和5头韩延牛血清样品分别混在一起获得延边黄牛血清混合样和韩延牛血清混合样。之后分别取两个品种牛的血清混合样以5000rpm离心10min，取上清，以10000rpm离心30min；取上清放入超高速离心机中，以60000rpm离心3h；弃上清，用0.01 M PBS反复将沉淀吹下，用移液器将悬液吸入EP管中，再使用移液器反复吹打使其溶解，最后将悬液于超速离心管中，放入超高速离心机中，以60000rpm离心2h；弃上清，吸入离心管中，加入0.01 M PBS溶液，用移液器将沉淀反复吹打，使其完全混匀即为Exosome溶液。

1.4 延边黄牛和韩延牛血液Exosome RNA的提取 血清Exosome中的RNA提取主要按Exosome DNA Extraction Kits试剂盒(美国Illumina公司)步骤进行。

1.5 小RNA（sRNA）的高通量测序 将上述获得小RNA样品使用PAGE胶分离18~50nt之间的条带，纯化回收小RNA。使用T4 RNA连接酶将获得的片断两端分别与3′和5′接头连接，然后进行反转录反应，然后PCR扩增，获得cDNA文库。将构建好的文库使用Agilent2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System进行质量和产量的检测。最后将获得的cDNA文库送往深圳华大基因组公司，通过该公司的Illumina测序平台完成小RNA高通量测序。

2 结果与分析

2.1 总RNA的质量 提取的血液Exosome RNA未经DNase和RNase处理时，电泳条带显示其存在的RNA主要为5S和少量的18S，而经DNase消化后，电泳条带显示与未处理时相同。但经RNase处理后，样品内的RNA完全被消化，电泳图内未显示有任何条带(图1)。结果说明，样品中提取的RNA降解程度较低，完整性较好，无其他基因组污染，可用于后续研究。

图1 总RNA电泳检测 1-3：血液Exosome总RNA

图2 延边黄牛和韩延牛血液Exosome中差异表达miRNAX轴代表比较组，Y轴是对应的小RNA数。

2.2 miRNA的鉴定 miRNA的鉴定结果表明：在延边黄牛血液Exosome中有912条miRNA与成熟的miRNA相匹配，新发现的miRNA为115条；在韩延牛血液Exosome中有905条miRNA与成熟的miRNA相匹配，新发现的miRNA为317条。具体结果见表1。

表1 小RNA的基因组比对与miRNA鉴定结果

2.3 miRNA表达定量 为检测延边黄牛和韩延牛血液Exosome中miRNA表达水平，进而为后续的差异分析提供数据，对两个牛品种鉴定出的miRNA进行表达量分析。结果表明：延边黄牛中有912个已知miRNA表达，韩延牛中有905个已知miRNA表达，其中有795个miRNA在两个样品中都表达。只在延边黄牛中表达的miRNA有112个，而只在韩延牛中表达的miRNA有105个。新miRNA预测结果分析可知，在两个品种中一共检测到187个新miRNA，延边黄牛中有41个新miRNA，韩延牛中有146个新miRNA，其中35个在两个品种中都表达。只在延边黄牛中表达的新miRNA 有6个，韩延牛中有111个。

2.4 差异表达miRNA的筛选 （1）通过比较延边黄牛和韩延牛血液Exosome中miRNA的表达量，筛选差异表达miRNA，为后续分析提供基础。本试验采用DEGseq进行差异miRNA的筛选。筛选的差异miRNA统计见图2。结果表明：延边黄牛和韩延牛之间差异表达的miRNA一共是524个，其中上调表达的miRNA为271个，下调表达的miRNA为253个。（2）本试验对韩延牛和延边黄牛之间的524个差异表达miRNA进行了分析，其中已知miRNA 382个，新miRNA142个。相对于延边黄牛，在韩延牛中显著上调的miRNA有217个，显著下调的miRNA有253个。表2分别列出了前10个在两个品种中显著上调和显著下调表达的 miRNA。

表2 在延边黄牛与韩延牛血液Exosome 中显著差异表达的miRNA

注：显著性差异的标准：Log2Ratio(Y/H)>1且P<0.05；差异miRNA按照差异倍数从小到大排序；up：相对于延边黄牛，在韩延牛中上调表达miRNA；down：为下调表达。

2.5 差异表达miRNA的靶基因预测 为了更好的研究这些差异miRNA的靶基因，本试验采用RNAhybrid和miRanda靶基因预测软件对获得差异表达的524个miRNA的靶基因进行预测。结果表明：在延边黄牛和韩延牛血液Exosome miRNA中共预测到52348个靶基因，并发现许多miRNA可以靶向多个靶基因。其中在延边黄牛中显著下调表达的miR-9-5p靶向的基因是最多的，共靶向 257个靶基因，其次是在延边黄牛中显著上调表达的miR-99b，共靶向213个靶基因。

2.6 差异表达miRNA的靶基因GO显著性富集分析 差异表达miRNA调控的靶基因参与的生物学过程主要包括：行为过程(behavior)、生物粘附(biolo-gial adhesion)、生物相(biological phase)、生物调控(biological regulation)和细胞杀伤(cell killing)等(图3黑色部分)；细胞组分主要包括：细胞连接(cell junction)、细胞组件(cell part)、胶原蛋白三聚体(collagen trimer)和细胞外基质(extracellar matrix)等(图3中灰色部分)；分子功能主要涉及抗氧化活性(antioxidant activity)、结合功能(bin-ding)、催化性能(catalytic activity)和通道调控功能(channel regulation activity)等(图3浅灰色部分)。这些靶基因被富集到3473条生物学过程，394条细胞组分以及879条分子功能。

图3 GO功能分类

2.7 差异miRNA的靶基因Pathway显著性富集分析 本试验预测获得的miRNA的靶基因总共被注释到326条信号通路中，其中最显著富集的通路为mTOR信号传导通路，有635个靶基因被注释到该通路中。在本文中只展示富集程度排名前20的pathway条目，具体结果见图4和表3。其中发现在两个品种牛之间显著差异表达miR-9-5p和miR-99b调控的一些靶基因都被注释到了mTOR信号通路。

注：RichFactor指差异小RNA的靶基因中位于该pathway条目的基因数目与所有有注释基因中位于该pathway条目的基因总数的比值。从图4中可以看出RichFactor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做过多重假设检验校正之后的Pvalue，取值范围为0到1，越接近于零，表示富集越显著。

表3 靶基因显著富集的20条KEGG通路

3 讨论与结论

3.1 有关延边黄牛的研究 延边黄牛是我国著名五大地方品种之一，属于山区役肉兼用型黄牛品种，是我国畜禽品种基因库里宝贵的财富。延边黄牛作为东北地区的优良品种，其抗寒性好，耐粗饲，抗病性强，容易育肥，肉质嫩而细腻多汁，肌肉横断面呈大理石花纹状，味道鲜美可口，肉质明显优于其他品种的牛，不饱和脂肪酸含量明显高于其他品种牛，风味可与韩牛等媲美，是不可多得、具有中国特色的肉牛品种[10,11]。但是，延边黄牛存在生长周期长，出栏率低等缺点，生长效率是影响延边黄牛养殖业发展的关键因素之一[12]。因此，对于怎样提高延边黄牛的生长效率是现在发展延边黄牛产业的至关重要的问题之一。最近研究表明Exosome与细胞间通讯交流、免疫调节、信号传递、生长发育等过程有关，其组成成分复杂，如蛋白质、脂类和miRNA等[13, 14]。大量研究数据表明，来源于各种组织细胞中的miRNA可通过Exosome进入循环系统，最终到达靶器官而发挥作用[15-17]。同时一些研究者认为这种Exosome-miRNA可能是一类新的生物信使。因此，关于Exosome-miRNA 功能的研究正引起国内外研究者的关注。

3.2 关于靶基因的研究 靶基因预测是研究miRNA分子机制以及生物功能的必要步骤。在生物体中，miRNA与靶基因相互作用是基因表达调控中的一个重要环节。一个miRNA可以调控不同的靶基因，也可以多个miRNAs共同调控一个基因[18, 19]。因此，研究miRNA 与靶基因相互作用的关系对探索miRNA在生物体生长发育中的作用具有重要意义。

3.3 关于RNA-seq的测序 本试验通过RNA-seq测序分析，在延边黄牛和韩延牛血液Exosome中获得差异的524个差异表达miRNA，其中上调表达的271个，下调表达的253个。在524个差异表达miRNA中共预测出52348个靶基因，并发现许多miRNA 可以靶向多个靶基因，如miR-9-5p预测到257个靶基因。一个miRNA可以调控不同的靶基因的现象与前人研究相符。

3.4 关于靶基因的功能及通路分析 （1）为了进一步分析预测到的靶基因功能以及miRNA参与的生物学过程，采用GO富集和KEGG通路分析对预测到的靶基因进行分析，获得相关的通路。GO富集分析可知差异miRNA的靶基因被富集到3473条生物学过程，394条细胞组分以及879条分子功能。但上述靶基因在延边黄牛和韩延牛生长发育过程中的具体机制还需要进一步研究。（2）本试验对差异表达miRNA的靶基因进行了KEGG通路分析，结果发现这些预测得到的miRNA的靶基因总共被注释到326条信号通路中，其中排在前两位富集的通路是mTOR信号通路和MAPK信号通路。如有635个靶基因被注释到mTOR信号传导通路，有1046个靶基因被注释到MAPK信号通路。其中显著差异表达的miR-9-5p和miR-99b调控的一些靶基因都被注释到了mTOR和MAPK信号通路，因此推测血液Exosome中的miR-9-5p和miR-99b在延边黄牛和韩延牛生长发育差异的过程中可能发挥重要的作用。

因此，下一步研究工作重点将选取2个关键差异表达miRNA(miR-9-5p和miR-99b)研究miRNA是如何通过关键信号通路，特别是mTOR和MAPK信号通路调控延边黄牛和韩延牛生长发育调控的，从而在分子水平上探讨影响延边黄牛和韩延牛生长发育差异的机制。

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（2019–07–10）

国家自然科学基金项目（31660614）

S823.9+4

A

1007-1733(2019)10-0006-05