高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定鸡肝中庆大霉素残留量

牛华星 陈玲 杨修镇 刘少宁 尹伶灵 章安源

高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定鸡肝中庆大霉素残留量

牛华星 陈玲 杨修镇 刘少宁 尹伶灵 章安源

（山东省兽药质量检验所 山东省畜产品质量安全检测与风险评估重点实验室 山东 济南 250022）

应用超高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)，建立了鸡肝中庆大霉素c组分的检测方法。样品经磷酸盐缓冲液提取，阳离子交换柱净化，Poroshell HPH-C8(3.0×100mm，2.7μm)为分离色谱柱，以50mmol/L乙酸铵溶液(含2.0%氨水和0.2%甲酸)-乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源正离子检测模式(ESI+)和多反应监测(MRM)模式测定，外标法定量。结果表明，庆大霉素在进样浓度在10~500ng/ml范围内线性关系良好(r2=0.9990)；方法检出限和定量限分别为10μg/kg和25μg/kg；25、50、100、200μg/kg4个添加水平下，平均回收率在80%~100%之间，相对标准偏差RSD≤9.65%。本方法准确、简单、快速。

液相色谱-串联质谱 鸡肝 庆大霉素 组分

庆大霉素[1]是由小单孢菌产生的抗生素，至少由4种主要成分(C1、C1a、C2、C2a组分)和几种微量成分组成(Claes等, 1984; Thomas和Tappin, 1974)属氨基糖苷类抗生素药(aminoglycosides，AGs)[2]。由于价格低廉，被广泛使用于食品动物，从而造成食品中的药物残留问题。为方便日常监测，本文中采用液相色谱一串联质谱法建立了鸡肝中能同时测定庆大霉素4个组分的残留分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 Waters Xevo TQ-S高效液相-串联质谱仪(配有电喷雾离子源)；CPA225D分析天平：感量0.01mg；PL602-S电子天平：感量0.01g；Milli-Q 超纯水设备；水相针式滤器：孔径0.22μm；Agilent PCX(60mg, 3ml)固相萃取柱。

1.1.2 标准品 庆大霉素(Gentamicin)：纯度≥94%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，其中C1组分含量为31.0%，C1a组分含量为22.2%，C2与C2a组分含量为46.8%。

1.1.3 试剂 乙腈、甲酸、甲醇、氨水、乙酸、乙酸胺为色谱纯；三氯乙酸、乙二胺四乙酸、磷酸二氢钾为优级纯。超纯水为符合GB/T 6682规定的一级水。

1.1.4 标准贮备液的配制 准确称取庆大霉素标准品配制成1000μg/ml的标准贮备液，4℃避光保存，有效期为3个月。吸取标准储备液适量，用0.3%乙酸溶液稀释定容，得到庆大霉素浓度为10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L和500μg/L的标准工作液，置4℃冰箱中避光保存。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 根据参考文献[3]方法称取试料2g±0.02g，于50ml离心管中，加10ml磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾1.36g，用980ml水溶解，分别加入乙二胺四乙酸二钠0.15g和三氯乙酸20g，溶解混匀并定容至1000ml，至4℃保存，有效期一个月)，涡漩混匀1min，超声5min，以10000r/min离心10min。取上清液于另一50ml离心管中。残渣再加磷酸盐缓冲液10ml，重复提取一次，合并两次提取液并定容至20ml，涡旋混匀，为备用液。依次用甲醇5ml和水5ml活化PCX阳离子交换柱，取10ml的备用液上柱，流干后，依次用水5m和甲醇5ml淋洗，抽干，用氨化甲醇5ml洗脱，收集洗脱液于10ml塑料离心管中，于40℃下用氮气吹至近干，用0.3%醋酸水溶液溶解并定容至1ml，充分涡旋，用0.22µm滤膜过滤，上机待测。取空白样品，同法处理，获得试样基质空白溶液。空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

1.2.2 液相色谱条件 色谱柱：Poroshell HPH-C8(3.0×100mm，2.7μm)；流动相：A为50mmol/L乙酸铵溶液(含2.0%氨水和0.2%甲酸)，B为乙腈；流速：0.4ml/min，进样量：5µl。柱温：35℃；梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.2.3 质谱条件 根据参考文献[4, 5]方法，电喷雾离子源，扫描方式：正离子扫描，检测方式：多反应监测(MRM)。毛细管电压：2.5KV，离子源温度：150℃，脱溶剂气温度：500℃，锥孔气流速：50L/h，脱溶剂气流速：1000L/h，倍增器电压：650V，二级碰撞气：氩气。定性离子对、定量离子对、保留时间、锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。

表2 庆大霉素质谱检测参数

注：带*的离子对是定量离子对

1.2.4 基质匹配标准曲线的制备 精密量取相应庆大霉素标准工作液用空白基质溶液制得浓度为10、25、50、100、200、500ng/ml的系列基质匹配标准工作溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。求回归方程和相关系数。

1.2.5 准确度和精密度 准确称取空白试料样品鸡肝脏2±0.02g，准确加入适量标准工作液，使样品中药物的添加浓度为25μg/kg(定量限)、50μg/kg (1/2MRL)、100μg/kg(MRL)和200μg/kg(2MRL)，提取净化处理后，经高效液相色谱－串联质谱仪测定，添加浓度各设置5个平行，重复3批。

1.2.6 测定方法 取试样溶液和相应的基质匹配标准溶液，作单点校准，外标法计算。基质匹配标准溶液及试样溶液中各药物的峰面积均应在仪器检测的线性范围内。

表3 试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围 (%)

2 结果

2.1 线性考察

以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线(表4)。庆大霉素药物在浓度为10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L和500μg/L系列基质添加浓度标准溶液进行分析检测，得到线性回归方程见表4，在10~500 ng/ml的浓度范围内，该药物的定量离子峰面积与浓度均呈良好线性关系，相关系数均大于0.990。

表4 各可食性组织中庆大霉素标准曲线回归方程和相关指数

表5 鸡肝脏中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度 (ng/ml、%)

2.2 检测限和定量限

鸡肝中添加浓度为25μg/kg时，庆大霉素峰面积响应值和信噪比满足定量限的要求信噪比(S/N)≥10，因此确定方法的定量限为25μg/kg。添加浓度为10μg/kg时，庆大霉素峰面积响应值和信噪比满足定量限的要求信噪比(S/N)≥3，因此确定方法的检测限为10μg/kg。

2.3 回收率及重复性试验

鸡肝中添加庆大霉素，液质分离良好，无干扰，添加浓度25μg/kg(定量限)、50μg/kg(1/2 MRL)、100μg/kg(MRL)和200μg/kg(2MRL)，添加浓度各设置5个平行，重复3批。批内批间变异系数均小于10%，阳性添加样品的回收率在80%~ 100%(表5)批内批间相对标准偏差均小于9%。

3 讨论与小结

（1）由于液相色谱－串联质谱存在基质效应，而且基质中某些干扰组分的存在会使待测组分离子生成的速度与标准品相比有显著不同，因此本试验对品基质效应进行研究：用空白样品制作空白基质吹干后，加入一定量标准溶液，制成基质标准溶液；在空白样品中加入一定量标准溶液，制成基质匹配标准溶液；与相应浓度的纯标准溶液比较，发现基质效应明显，因此定量时采用基质匹配标准曲线。（2）方法前处理简单，回收率和精密度能满足分析要求，符合我国《兽药残留技术规范》[6]的要求，能快速准确检测鸡肝中的庆大霉素残留。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015. 1324-1326.

[2] 侯亚丽, 苏亮, 丁平等. 庆大霉素的残留检测方法庆大霉素残留[J]. 中国饲料, 2007(12): 28.

[3]田强兵, 巨欢等. 高效液相色谱-质谱法测定鱼肉中庆大霉素主要组分C1、C1a、C2[J]. 理化检验(化学分册). 2019, 55(1).

[4] 刘雪红, 张秀琴, 侯颖等. 超高效液相-串联质谱法检测牛奶中7种氨基糖苷类残留[J]. 中国兽药杂志, 2015, 49(3): 48-52.

[5]赵静, 刘婷, 蔡柏岩等. HPLC法测定原料乳中庆大霉素残留的研究[J]. 食品研究与开发, 2015, 36(9): 95-97.

[6]农业部文件农牧发[2003]1号. 关于发布《兽药残留试验技术规范(试行)》的通知[Z]. 2003.

（2019–08–05）

S859.84

A

1007-1733(2019)10-0011-03