黄芩素对压力诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡的影响

刘伟 冯晶 夏平 浦飞飞 王志伟 汪朋 黄觅 赵晓龙

武汉市第一医院骨科（武汉430030）

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）及其继发的病理改变是引起下腰痛（low back pain，LBP）的最主要原因，是脊柱失稳、颈椎病、腰椎管狭窄等一系列脊柱退行性疾病的病理基础［1］。近年来，提取自天然植物的化合物已用于治疗退行性疾病，疗效较好且副作用较少［2-3］。黄芩素是从黄芩干根中提取的一种黄酮类化合物，在中国和其他一些国家被广泛使用。黄芩素具有抗氧化、抗病毒、抗血栓、抗心血管疾病、体内外抗肿瘤等作用。黄芩素因其可抑制软骨细胞的凋亡进而延缓骨性关节炎退变的作用，在骨性关节炎防治中被广泛研究［4］，然而，迄今为止，黄芩素能否延缓椎间盘退变，以及延缓椎间盘退变的机制鲜有报道。本研究利用压力诱导的髓核细胞退变模型，探讨黄芩素是否抑制髓核细胞的凋亡，为黄芩素抗椎间盘退变的作用机制研究提供线索，并且能为中药研发提供新思路以及理论依据。

1 材料与方法

1.1 正常椎间盘标本的获取选取自2018年1月至2019年1月在武汉市第一医院行脊柱侧弯矫形术的患者。手术收集了4 例来自特发性脊柱侧弯患者的正常髓核标本（平均年龄15.5 岁，范围10 ～21 岁）。取材节段为L4∕L5或者L5～S1，所有标本均在髓核离体30 min 内获取。术前所有患者根据Pfirrmann 分级标准进行退变程度的分级，4 例髓核标本均为Ⅱ级，为正常髓核标本。本研究经武汉市第一医院临床研究伦理委员会批准，所有患者或其父母均签署知情同意书。

1.2 药品与试剂黄芩素（纯度≥98%）购自阿拉丁工业公司（美国）。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色剂及CCK8 细胞活力检测试剂盒购自Beyotime（中国上海）。兔多克隆抗体Bax，兔多克隆抗体Bcl-2，兔单克隆抗体cleaved-caspase 3，兔单克隆抗体cytochrome C、兔单克隆抗体ERK-1∕2、兔单克隆抗体p-ERK-1∕2 及兔多克隆抗体GAPDH一抗和山羊抗兔的二抗均购自Abcam（Cambridge，UK）。细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司（上海，中国）。二甲基亚砜（DMSO）和胶原酶Ⅱ购自Sigma（St.Louis，MO，USA）。细胞培养基购自Gibco（Grand Island，NY，USA）。

1.3 髓核细胞分离与培养将新鲜髓核组织剪成小碎块，用0.1% Ⅱ型胶原酶消化6 ～8 h，离心后收集沉淀，以含20% 胎牛血清的DMEM∕F12 培养，置于含5%CO2的培养箱中，7 d 后首次更换培养液，以后每周更换培养液2 次。在倒置相差显微镜下观察原代髓核细胞形态，细胞融合90%后传代。P= 1 代的髓核细胞用来后续体外实验研究。

1.4 髓核细胞处理（1）不同浓度黄芩素（0、5、25、50、75、100 μmol∕L）处理正常髓核细胞，24 h 后测髓核细胞的活力，选取最佳处理浓度；（2）本实验分为3 组：正常组（A 组），取处于对数生长期，生长状态良好的正常人髓核细胞，以每孔5 × 105个接种于细胞培养6 孔板，37 ℃、5%CO2培养箱中培养；不用（B 组）和用50 μmol∕L 黄芩素预处理24 h后，置于1 Mpa压力培养箱中培养（C组）。24 h后进行实时荧光定量PCR、Western Blot、Tunel 等一系列检测。

1.5 CCK8取生长状态良好的压力诱导的髓核细胞，胰酶消化收集细胞，用培养基将细胞密度调整5 × 104∕mL，接入96 孔板，每孔100 μL 细胞悬液，同时设空白组（在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS），37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h；待细胞贴壁后，不同浓度黄芩素处理髓核细胞（0、5、25、50、75、100 μmol∕L），每组3 个复孔，37 ℃培养箱中培养；24 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培养4 h；酶标仪测定各孔吸光值OD450。

1.6 实时荧光定量PCR（Realtime PCR）根据使用说明书，使用Trizol 试剂（Invitrogen）从髓核细胞中提取总RNA。采用分光光度法测定RNA浓度后，按照逆转盒使用说明书，用PrimeScriptTMRT Master Mix（TakaRa，Dalian，China）逆转录RNA。以GAPDH 为内参，实时PCR 定量分析各组细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3 和cytochrome C 的表达量。每个样品设置3 个副孔，采用2-△△Ct法计算基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence table

1.7 Western Blot 检测收集各组细胞，提取蛋白，测定蛋白浓度。取20 μg 蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。利用半干法将蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡硝酸纤维素膜，室温摇床封闭2 h。加入一抗Bax（1∶5 000 稀释），Bcl-2（1∶2 000稀释），cleaved-caspase 3（1∶1 000 稀释）、cytochrome C（1∶10 000 稀释）、ERK（1∶1 000 稀释）、p-ERK（1∶2 000 稀释）和GAPDH（1∶500 稀释），4 ℃过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗，室温孵育1 h，暗室曝光，观察结果，用BandScan 分析胶片灰度值。

1.8 Tunel收集各组髓核细胞。用4%多聚甲醛固定1 h 后，用0.1%Triton X-100 培养10 min，用PBS 洗涤3 次。按照使用说明书，用原位细胞凋亡检测试剂盒（F.Hoffmann La Roche Ltd.，瑞士巴塞尔）和40，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞进行染色。吸水纸擦干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.9 统计学方法所有数据均使用均数±标准差的形式表示。本实验使用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析，每组实验重复3 次。采用单因素方差分析和两两比较分析方法。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩素增强髓核细胞的活力笔者应用不同浓度的黄芩素处理正常髓核细胞，24 h 后CCK8 检测髓核细胞的活力。结果表明黄芩素浓度为0 ～50 μmol∕L 时，随着浓度的增加，髓核细胞活力逐渐增强。50 μmol∕L 时，髓核细胞活力最强，与对照组相比，差异有统计学意义（P ＜0.05）。50 μmol∕L以后，随着黄芩素浓度的增加，髓核细胞的活力逐渐减弱。因此，黄芩素可以增强髓核细胞的活力，并且具有浓度依赖性，其中浓度为50 μmol∕L 时黄芩素的作用最强（图1）。

图1 黄芩素细胞活力和浓度依赖性Fig.1 Baicalein nucleus pulpocyte viability and concentration dependent

2.2 黄芩素抑制促凋亡因子的转录和翻译收集正常对照组、压力组及压力+黄芩素组等3 组细胞的RNA 和蛋白，进行RT-PCR 和WB 检测。结果表明，压力刺激增加Bax、cleaved-caspase 3 、cytochrome C 等促凋亡因子的转录和翻译，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。然而黄芩素处理后，促凋亡因子的转录和翻译明显减弱（P ＜0.05，图2）。

2.3 黄芩素促进Bcl-2 的转录和翻译对上述3组细胞的RNA 和蛋白进行检测。RT-PCR 结果表明，压力刺激减少Bcl-2 的转录，与压力组比较，黄芩素组的Bcl-2 转录明显增加，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。WB 结果表明，压力刺激明显减少Bcl-2 的表达，与压力组比较，黄芩素明显增加Bcl-2 的表达，差异具有统计学意义（P ＜0.05，图3）。

图2 Bax，cleaved-caspase 3 和cytochrome C 的表达Fig.2 The expression of Bax，cleaved-caspase 3 and cytochrome C

图3 Bcl-2 的表达Fig.3 The expression of Bcl-2

2.4 黄芩素抑制压力诱导的髓核细胞的凋亡50 μmol∕L 的黄芩素处理髓核细胞，1 MPa 压力刺激髓核细胞，24 h 后收集3 组细胞，采用Tunel 方法测髓核细胞的凋亡。Tunel 结果表明，压力刺激明显增加髓核细胞的凋亡。然而，黄芩素处理后，压力诱导的髓核细胞凋亡明显减少（图4）。

图4 髓核细胞的凋亡Fig.4 Apoptosis of nucleus pulposus cells

2.5 黄芩素抑制MEK/ERK 信号通路的激活MEK∕ERK 信号通路在椎间盘退变进程中起重要作用，笔者收集上述3 组细胞的蛋白，检测MEK∕ERK 信号通路的活性。结果表明，压力促进ERK的磷酸化，然而黄芩素处理后ERK 磷酸化的程度明显减弱（图5）。

3 讨论

椎间盘退变的危险因素主要包括过度压力、基因易感性、营养缺乏、糖尿病、细胞外基质含量及种类的改变、基质金属蛋白酶的表达增多及促炎症因子的过表达等［5］。在以上众多致病因素中，过度压力在椎间盘退变中的作用尤为突出。有证据表明椎间盘的生理压力从0.1 ～0.9 MPa。适度压力对椎间盘具有保护作用，然而过度的压力刺激可加剧椎间盘退变进程［6］。髓核细胞作为椎间盘组织中的重要成员，是椎间盘组织形成和维持组织代谢和结构的重要效应细胞。前期研究表明，髓核细胞在受到压力、缺氧等各种退变因素刺激后，自身大量炎症介质表达增加，并被迅速分泌到髓核组织中，通过增加髓核细胞凋亡，引起椎间盘退变［7-8］。研究结果证实控制髓核细胞中压力诱导的髓核细胞凋亡可有效缓解椎间盘退变。因此，试图延缓过度压力对髓核细胞的作用在椎间盘退变的研究中具有重要意义。

图5 MAPK∕ERK 信号通路的激活Fig.5 Stimulation of MAPK∕ERK signaling pathway

黄芩素是从植物黄芩中提取的黄酮类化合物。有研究［9］报道，黄芩素具有抗炎、抗菌、抗氧化等生物学功效。黄芩素可通过抑制细胞凋亡进而达到治疗疾病的目的。近年研究表明，黄芩素处理可以增加Bcl-2 的表达及导致caspase 活化的阻断［10］。在骨性关节炎中，LI 等［11］发现，黄芩素能够减弱IL-1β介导的软骨细胞炎症反应以及抑制软骨细胞凋亡，从而延缓关节软骨细胞的退变。另外，脊髓损伤后，黄芩素可以通过激活自噬，进而减少细胞凋亡［12］。本研究发现，压力刺激能够促进髓核细胞凋亡，黄芩素能够逆转过度压力对髓核细胞凋亡的调控作用。

MAPK 信号通路在椎间盘退变中发挥重要作用。ERK 属于MAPK 激酶家族，其转导多种细胞外刺激进入细胞内信号级联，参与髓核细胞外基质合成分解代谢及细胞凋亡进程［13］。TNF-α与受体结合后可激活MAPK∕ERK 信号通路，通过增加促凋亡蛋白Bax 及减少抑制凋亡蛋白Bcl-2 的表达，促进髓核细胞凋亡［14］。然而，抑制MAPK∕ERK 信号通路的激活，可以明显抑制IL-1β诱导的髓核细胞外基质退变及髓核细胞凋亡，从而延缓椎间盘退变进程［15］。本研究中，压力刺激明显增加ERK-1∕2 的磷酸化，黄芩素处理后ERK-1∕2 的磷酸化程度明显减弱，所以笔者认为黄芩素通过抑制MAPK∕ERK 信号通路的激活延缓压力诱导的髓核细胞凋亡。

本研究只是初步探讨了黄芩素对MAPK 信号通路的影响，未进行靶向干预研究。后续实验可靶向调控MAPK 信号通路，观察黄芩素对压力诱导髓核细胞凋亡的影响。