p53蛋白O-乙酰氨基葡萄糖修饰介导宫颈癌细胞的顺铂耐药

王漪 陈必良

空军军医大学第一附属医院西京医院妇产科（西安710032）

癌细胞营养消耗增高导致细胞代谢失调是肿瘤的重要特征。在肿瘤细胞中，氨基己糖合成途径代谢异常活跃，利用葡萄糖、谷氨酰胺、乙酰辅酶A 和尿苷三磷酸最终生成尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）［1］。进一步的，在β-N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶（O-GlcNActransferase，OGT）作用下，将O-乙酰氨基葡萄糖（O-linked-β-Nacetylglucosomaine，O-GlcNAc）从UDP-GlcNAc 转移至蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基，导致一种蛋白翻译后修饰，称为O-GlcNAc 糖基化修饰［2］。另一方面，β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷水解酶（O-GlcNAcase，OGA）负责将蛋白质O-GlcNAc 糖基化移除。O-GlcNAc 糖基化修饰在肿瘤发生、发展中的作用越来越多的被报道。近来研究［3］发现，在乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌和肺癌中，O-GlcNAc 糖基化水平均明显升高。O-GlcNAc 糖基化可以促进胰腺癌细胞增殖，并能够增强乳腺癌细胞的侵袭和转移［4-5］。除此之外，在肺癌中，O-GlcNAc 糖基化水平升高能够促进肿瘤的生长［6］。有报道［7］显示，原癌基因和抑癌基因的O-GlcNAc 糖基化修饰在促进肿瘤生长中也发挥了重要作用，如p53。已有研究［8］显示，在宫颈癌细胞中高表达OGT 可导致癌基因蛋白E6 和E7 表达增加，而干扰OGT 表达则可抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和转移。近来，有研究［9］显示NF-κB 蛋白的O-GlcNAc 糖基化可以促进宫颈癌细胞的肺转移，而抑制AMPK 的O-GlcNAc 糖基化则可导致宫颈癌细胞死亡［10-12］。因此，O-GlcNAc 糖基化在宫颈癌细胞的增殖、侵袭和转移，以及临床耐药性中可能发挥重要作用。尽管如此，作为一种重要的抑癌基因蛋白，p53 的O-GlcNAc 糖基化修饰与宫颈癌进展的关系，及其对宫颈癌细胞的增殖、凋亡和耐药性的影响尚未有研究。因此，本研究旨在研究揭示p53 O-GlcNAc 糖基化水平与宫颈癌进展的关系，以及p53 O-GlcNAc 糖基化在宫颈癌细胞增殖和凋亡，特别是顺铂抗性中的作用。

1 材料和方法

1.1 临床样本收集本院宫颈癌I 期（CA I）临床标本8 例，宫颈癌Ⅱ期（CAⅡ）标本8 例，宫颈上皮内瘤样病变Ⅲ级（CINⅢ）标本8 例，宫颈癌旁组织（CON）标本8 例，-80 ℃保存，用于后续免疫组化和Western Blot 检测。在患者知情同意下获取临床样本，实验获得本单位伦理委员会审批支持（批件号KY20163089-1）。

1.2 细胞培养和处理人宫颈癌C-33A 细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，采用MEM-EBSS 培养基（Gibco，美国）培养，加入10%胎牛血清（Hyclone，美国）和1%青链霉素，37 ℃培养于5% CO2培养箱。细胞分为对照组（CON）、顺铂（DDP）处理组，顺铂和OGA 抑制剂TMG 处理组（DDP+TMG）、顺铂和OGT siRNA 干扰组（DDP+si-OGT）。顺铂（Biovision，美国）处理浓度50 μmol∕L，TMG（MCE，美国）浓度10 μmol∕L，均处理24 h。

1.3 siRNA 转染人OGT 特异性siRNA 购买于Santa Cruz 公司（美国）。将C-33A 细胞接种于6 孔板，待细胞生长至60%～80%融合时进行siRNA 转染。5 μL 的siRNA 加入100 μL 转染培养基（Santa Cruz）混匀；另5 μL 的转染试剂（Santa Cruz）加入100 μL 的转染培养基混匀，将2 种液体混匀，室温孵育45 min。用转染培养基洗涤细胞，加入0.8 mL∕孔的转染培养基，加入上述siRNA 混合液，37 ℃培养6 h 后换正常培养基，继续培养24 h 后进行后续实验。

1.4 免疫组化宫颈组织冰冻切片，厚度6 μm，室温固定，蒸馏水漂洗后3% H2O2室温孵育30 s。羊血清（中杉金桥，中国）室温封闭1 h，滴加glycosylated p53 抗体（Detroit R&D，美国）（1∶100），4 ℃孵育过夜。PBS 冲洗后，滴加生物素标记山羊抗小鼠二抗（1∶1000，碧云天，中国），37 ℃孵育1 h。PBS 冲洗后，DAB 显色后封片。

1.5 Western Blot冻存的宫颈组织和细胞加入RIPA 裂解液（碧云天）裂解，20 000 g，4 ℃离心，收取上清蛋白。SDS-PAGE 凝胶电泳后，250 mA、100 min 转至PVDF 膜。glycosylated p53 一抗（1∶1 000）、p53 一抗（1∶1 000，碧云天）、OGT 一抗（1∶1 000，Abcom，美国）和Cleaved Capase-3 一抗（1∶1 000，Abcom）4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（1∶1 000，碧云天）室温孵育1 h。加入化学发光试剂，凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）中曝光检测。

1.6 细胞增殖采用CCK-8 试剂盒（同仁化学，日本）检测细胞增殖。在细胞处理24 h 后，按照说明书进行细胞增殖检测。

1.7 统计学方法数据表示为均数± 标准差。使用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，跟以Newman-Keuls分析检测两两组间差异。以P值小于0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织中OGT 表达和p53 糖基化水平升高采用免疫组化检测不同宫颈组织中p53 糖基化水平。由图1A 可见，与癌旁组织相比，宫颈上皮内瘤样病变Ⅲ级（CINⅢ）组织内已可见p53糖基化水平的明显升高。宫颈癌组织内（CAⅠ，CAⅡ）p53 糖基化水平呈进一步增高趋势，并随着宫颈癌分期进展，p53 糖基化水平呈进行性增高。进一步地，western blot 结果显示，与对照组相比，CINⅢ组织内OGT 表达已有显著增加，而宫颈癌组织OGT 蛋白表达随病理分期进展进行性升高（P＜0.05）（图1B）。此结果表明，在癌前病变的CINⅢ级组织内，OGT 表达增加和p53 糖基化水平升高已经出现，宫颈癌组织内p53 糖基化水平与癌症进展呈正相关，并可能源于OGT 表达增加导致的O-GlcNAc 糖基化。见图1。

图1 不同宫颈组织中p53 糖基化水平和OGT 表达变化Fig.1 The levels of p53 O-GlcNAcylation and OGT expression in different cervical tissues

图2 TMG 所致p53 O-GlcNAc 糖基化介导宫颈癌细胞顺铂抗性Fig.2 p53 O-GlcNAcylation induced by TMG increased the resistance of cervical cancer cells to cisplatin

2.2 p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化引起宫颈癌细胞顺铂抗性增强采用OGA 特异抑制剂TMG 处理C-33A 细胞，抑制O-GlcNAc 糖基化去除活性，引起p53 O-GlcNAc 糖基化（gly-p53）水平升高（图2A）。同样，TMG 复合顺铂处理组（D+T）p53 糖基化水平较DDP 单独处理组增高（图2A）。DDP 处理引起C-33A 细胞caspase-3 剪切形式（Cl-Casp3）增加，而TMG 干预则降低了DDP 引起的caspase-3 剪切活化（图2A）。此结果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化可拮抗DDP 导致的宫颈癌细胞凋亡。CCK-8 细胞活力检测结果显示，DDP 处理导致了宫颈癌细胞活力降低，TMG 复合处理则可逆转顺铂引起的宫颈癌细胞活力降低（图2B）。见图2。

2.3 抑制p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化增强宫颈癌细胞顺铂敏感性为进一步明确O-GlcNAc 糖基化p53 在顺铂所致宫颈癌细胞凋亡中的作用，采用siRNA 对C-33A 细胞OGT 表达进行干扰。结果显示，siRNA 干扰OGT（si-OGT）显著降低了对照组和实验组细胞p53 的O-GlcNAc 糖基化水平（图3A）。DDP 处理显著增加了宫颈癌细胞caspase-3 剪切体表达，而si-OGT 则进一步增强了DDP 所致的C-33A 细胞caspase-3 剪切活化（图3A）。细胞活力检测发现，si-OGT 引起了DDP 所致的细胞活力下降进一步降低（图3B）。这些结果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化水平降低可增强DDP 对宫颈癌细胞的致凋亡作用。见图3。

图3 OGT 表达抑制降低p53 O-GlcNAc 糖基化并增强顺铂对宫颈癌细胞作用Fig.3 Inhibition of OGT decrease p53 O-GlcNAcylation and enhance effects of cisplatin on cervical cancer cells

3 讨论

宫颈癌是女性生殖系统最常见恶性肿瘤，位于女性最常见癌症死因的第4 位［13］。手术清除辅助同步放化疗是目前宫颈癌的标准治疗方法，晚期宫颈癌的传统治疗策略是放疗联合顺铂化疗［14］。顺铂是宫颈癌常用一线化疗药物，然而宫颈癌细胞容易对顺铂产生耐药性，最终导致肿瘤复发，化疗失败［15］。因此，更深入理解化疗时宫颈癌细胞凋亡抵抗的分子机制，有助于鉴别宫颈癌新的潜在治疗靶点，改善治疗效果。

近来，在多种肿瘤中均发现了O-GlcNAc 糖基化水平升高（hyper-O-GlcNAcylation），如乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌和肺癌，并在肿瘤发生和进展中发挥作用［3，16］。研究［9］显示，多个分子的O-GlcNAc糖基化参与了肿瘤进展，如NF-κB 的O-GlcNAc 糖基化可促进宫颈癌细胞的肺转移。此外，热休克蛋白27（Hsp27）的O-GlcNAc 糖基化修饰可促使MCF-7 细胞的恶性转化［17］作为重要的抑癌蛋白，p53 已被证实在卵巢细胞中可被O-GlcNAc 糖基化修饰调控，并参与卵巢癌细胞生长和周期调节［18］。然而，p53 在宫颈癌的表达，及其在宫颈癌发生发展中的作用尚未见报道。本研究发现，在宫颈癌组织中，p53 糖基化水平升高，并与宫颈癌病理分级呈正相关。OGT 表达的同步升高表明p53 O-GlcNAc 糖基化在宫颈癌病情发展中可能发挥了重要作用。本研究结果提示了p53 O-GlcNAc糖基化和OGT 抑制作为宫颈癌临床辅助治疗的潜在可能。

O-GlcNAc 糖基化与肿瘤细胞的凋亡密切相关。在胰腺癌细胞中，高O-GlcNAc 糖基化显示出抗凋亡特性，并使NF-κB持续保持高活性。另一个研究［19］显示，在乳腺癌细胞中抑制OGT 活性，则可促进乳腺癌细胞的凋亡，表明高O-GlcNAc 糖基化阻止了乳腺癌细胞的凋亡。另一方面，O-GlcNAc糖基化还被证实可促进癌细胞增殖。肿瘤抑制因子FOXO3 的O-GlcNAc 糖基化引起了人胰腺癌细胞的异常增殖，这种促增殖作用源于FOXO3的O-GlcNAc 糖基化阻断了p53 的调控作用［20］。在肝癌细胞中，β-连环蛋白（beta-catenin）发生O-GlcNAc 糖基化导致了肝癌细胞的增殖、克隆形成，并抑制了肝癌细胞凋亡［21］。p53 在细胞中发挥多种重要调控作用，如细胞周期进程、DNA 损伤反应、细胞衰老和诱导凋亡。本研究发现，p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化导致了宫颈癌细胞凋亡减少和增殖能力升高，并可阻断顺铂引起的宫颈癌细胞凋亡和增殖降低。与本研究结果一致，在肺癌细胞的研究也证实，肺癌细胞的顺铂抗性与O-GlcNAc糖基化p53 有关［2］。这些结果表明，p53 O-GlcNAc糖基化可能是宫颈癌细胞发生顺铂化疗耐药的重要原因，为改善宫颈癌化疗耐药提供了一个可能靶标。

通常情况下，p53 在E3 泛素连接酶MDM-2 作用下发生泛素化，经蛋白酶体催化降解。有研究显示，在细胞中过表达OGT 可导致MDM-2 表达和磷酸化水平的升高［18］。此结果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化可能通过促进p53 的泛素蛋白酶体降解，进而促进了宫颈癌细胞的增殖并降低凋亡发生。肺癌细胞中p53 的O-GlcNAc 糖基化可促进p53 蛋白的泛素化和蛋白酶体水解［2］。然而，在乳腺癌细胞中的研究显示，p53 在Ser 149 位点的O-GlcNAc 糖基化促进了p53 蛋白的稳定［21］。并且，另一研究显示O-GlcNAc 糖基化可稳定并激活p53 途径，促进卵巢癌细胞增殖［18］。这种差异可能源于不同位点O-GlcNAc 糖基化的作用不同，因为p53 含有多个O-GlcNAc 糖基化位点［20］。并且上述O-GlcNAc 糖基化对p53 的稳定作用主要通过降低Thr155 的磷酸化而实现，但顺铂的主要作用位点为Ser15［2］。尽管如此，p53 O-GlcNAc 糖基化在宫颈癌发生发展中的作用，特别是其发生位点和机制应被进一步研究探索，为解决宫颈癌化疗耐药性提供更准确的目标［22］。