过表达长链非编码RNA LINC00377抑制甲状腺癌细胞的增殖和迁移的机制研究

王群 袁杰 黄军 汤继英 汪选斌 梅虹

1湖北医药学院附属太和医院普外3 科（湖北十堰442000）；湖北医药学院附属人民医院2肿瘤科，3甲状腺乳腺外科（湖北十堰442000）

甲状腺癌一种常见的头颈部和内分泌系统恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势，甲状腺癌发病机制不明确且起病隐匿，导致早期诊断较为困难［1-2］。深入了解甲状腺癌发生的分子机制及诊断标志物，是甲状腺癌临床研究的瓶颈。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一类由超过200 个核苷酸组成的非编码RNA，通过调控下游分子表达，在乳腺癌、甲状腺癌等很多肿瘤发生中发挥重要作用［3-5］。LINC00377 是一种新确定的LncRNA。本研究通过检测LINC00377 在甲状腺癌组织和细胞株中的表达情况，分析LINC00377与甲状腺癌发生的相关性，通过转染技术过表达甲状腺癌细胞中的LINC00377，分析过表达LINC00377 抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移的分子机制，为甲状腺癌发生机制研究及寻找诊断标志物提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 临床标本收集2016年8月至2018年4月湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心35 例甲状腺癌手术切除标本。男6 例、女29 例，年龄21～58 岁，平均（37.46 ± 4.19）岁。本研究获得本院伦理委员会同意，患者均签署知情同意书。甲状腺乳头状癌32 例，甲状腺滤泡癌3 例。临床分期：Ⅰ期16 例、Ⅱ期12 例、Ⅲ期7 例。所有患者术前均未行放化疗。每例标本均取得癌组织和相应的癌旁组织，由本院病理科专家进行病理学确认。手术标本于液氮中冷冻保存。

1.2 细胞与主要试剂RPMI 1640 培养基、DMEM∕F12 培养基和胎牛血清购自美国Gibco 公司。甲状腺癌细胞MDA-T32、B-CPAP、TT、TPC-1、SW579 和正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。引物（LINC00377、GAPDH、U6、miR-29a-3p和ADAMTS9）购自上海生物工程股份有限公司。Lipofectamine 3000 购自 美 国Invitrogen 公司。Transwell 小室购自美国Corning 公司。qRT-PCR 相关试剂盒购自日本TaKaRa 公司。CCK-8 试剂盒购自美国Sigma 公司阴性对照质粒及LINC00377 表达载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司。一抗ADAMTS9、α-Tubulin、AKT、p-AKT、p65、MMP2及二抗均购自美国CST 公司。

1.3 RNA 提取和实时荧光定量PCR（qRTPCR）35 例样本和细胞使用TRIzol 氯仿提取法提取，qRT-PCR 检测按照TaKaRa 试剂盒说明书配制反应体系，扩增条件设定为94 ℃预变性10 min；60 ℃25 s，72 ℃25 s，40 个循环。反应体系为20 μL。LINC00377 上游引物为5′-AGGCACGTCTTACATGACCA-3′，下 游 引 物 为5′-CCCTAGTGCTGTTCTTCTGACA-3′；GAPDH上游引物为5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物为5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；ADAMTS9上游引物为5′-ATTAGAGACCCTGAGCGAATACG-3′，下游引物为5′-GAAGTGGACGTTCGTGGGAA-3′；miR-29a-3p上游引物为5′-GGGTAGCACCATCTGAAAT -3′，下游引物为5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物为5--CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCt方法计算，以GAPDH为内参检测LINC00377 和ADAMTS9mRNA 的表达，以U6为内参检测miR-29a-3p 的表达。

1.4 细胞培养及质粒转染SW579、TT 和TPC-1细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM∕F12 培养基中，MDA-T32、B-CPAP 和Nthy-ori3-1 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期的SW579 细胞进行转染，转染操作根据LipofectamineTM3000 说明书进行，转染LINC00377 表达质粒作为实验组，以携带无意义序列的阴性对照质粒作为对照组。常规培养12 h 后，更换新鲜培养基。

1.5 生物信息学技术预测LINC00377 的下游分子机制采用LncBase Predicted v.2 软件预测LINC00377 下游互补结合的miRNA，采用TargetScan Release 3.1 软件预测下游miRNA 互补结合的下游基因。

1.6 Western Blot 实验检测ADAMTS9 蛋白的表达水平裂解细胞并提取总蛋白，制备蛋白样品30 μg，灌制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶并上样恒压100 V 电泳，聚偏氟乙烯膜恒流200 mA转膜，5%脱脂牛奶封闭70 min，一抗：ADAMTS9（1∶2 000 稀释）、CDK4（1∶500 稀释）、Cyclin D1（1∶1 000 稀释）、MMP-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶5 000）、N-cadherin（1∶5 000）及α-Tubulin（1∶1 000），4 ℃下孵育过夜。二抗室温孵育70 min，迅速以ECL 显影液显影，凝胶成像系统拍照。

1.7 CCK-8 检测转染后SW579 细胞增殖取对照组和实验组对数生长期的SW579 细胞制成细胞悬液，每组设4 个复孔，以每孔3×103个细胞铺于96孔板，每孔200 μL，每2 d换液。每24 h以CCK-8法进行检测，每孔加15 μL CCK-8 溶液，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育4 h，酶标仪测定在450 nm 波长处每组细胞的吸光度（OD）值，连续监测5 次。

1.8 Transwell 实验检测转染后SW579 细胞迁移取对照组和实验组对数生长期的SW579 细胞用无血清DMEM∕F12 培养基制成细胞悬液，每组设4 个复孔，以每室4 × 104个细胞铺于Transwell上室，每室200 μL。Transwell 下室加600 μL 含10%胎牛血清的DMEM∕F12 培养基。培养箱中培养24 h。1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，1 mL 0.1%结晶紫染色15 min。流水轻轻冲洗，棉签擦去未穿过孔膜的SW579 细胞。在倒置显微镜高倍镜下计数穿膜细胞数，多个视野下取均值，统计分析。

1.9 统计学方法统计学分析使用SPSS 18.0 统计软件，计量资料以均数±标准差表示，定量资料采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00377 在甲状腺癌组织和细胞株中低表达qRT-PCR 检测结果显示，LINC00377 在35 例甲状腺癌组织中的表达量相较癌旁组织明显下降（1.24 ± 0.54vs.7.27 ± 1.13，P＜0.01，图1）；LINC00377 在甲状腺癌细胞株中的表达量相较正常甲状腺滤泡上皮细胞明显下降（P＜0.01，图2），其中在SW579 细胞中下降的最明显。

图1 LINC00377 在甲状腺癌组织和癌旁组织中的表达水平Fig.1 Expression level of LINC00377 in thyroid cancer and adjacent tissues

图2 LINC00377 在甲状腺癌细胞株和正常甲状腺滤泡上皮细胞中的表达水平Fig.2 Expression level of LINC00377 in thyroid cancer cell lines and normal thyroid follicular epithelial cell

2.2 转染LINC00377 表达质粒促进SW579 细胞中LINC00377 表达转染LINC00377 表达质粒后，qRT-PCR 检测结果显示，实验组SW579 细胞中LINC00377 表达量相较对照组明显增加（1.07 ±0.22vs.15.96±0.65，P＜0.01）。

2.3 生物信息学软件预测LINC00377 下游分子机制LncBase Predicted v.2 软件预测显示，LINC00377 可互补结合miR-29a-3p；TargetScan Release 3.1 软件预测显示，miR-29a-3p 可互补结合ADAMTS9mRNA。见图3。

图3 生物信息学技术预测LINC00377 下游分子机制Fig.3 Bioinformatics technology predicts downstream molecular mechanism of LINC00377

2.4 过表达LINC00377 对SW579 细胞中miR-29a-3p 和ADAMTS9mRNA 表达水平的影响qRTPCR 检测结果显示，实验组SW579 细胞中miR-29a-3p mRNA 表达水平明显高于对照组（1.00 ± 0.03vs.0.12 ± 0.02，P＜0.01），ADAMTS9mRNA 表达水平明显低于对照组（1.00 ± 0.04vs.8.59 ± 0.27，P＜0.01），表明过表达LINC00377 可下调miR-29a-3p mRNA 的表达，上调ADAMTS9mRNA 的表达。

2.5 过表达LINC00377 对ADAMTS9 蛋白表达的影响Western Blot 检测结果（图4）显示，过表达LINC00377 后，ADAMTS9 蛋白表达水平升高，细胞EGFR∕AKT∕NFκB 通路蛋白p-AKT、p65、MMP2表达下调，AKT 蛋白表达无明显差异，表明EGFR∕AKT∕NFκB 通路被抑制。

2.6 过表达LINC00377 抑制SW579 细胞的增殖CCK-8 法结果（图5）显示，在第3、4、5 天，过表达LINC00377 的实验组SW579 细胞OD值明显低于对照组（P＜0.05），表明过表达LINC00377 可抑制SW579 细胞的增殖能力。

图4 过表达LINC00377 对SW579 细胞ADAMTS9 和EGFR∕AKT∕NFκB 通路蛋白表达的影响Fig.4 Effect of high-expressed LINC00377 on the expression of ADAMTS9 protein and EGFR∕AKT∕NFκB proteins in SW579 cells

图5 过表达LINC00377 对SW579 细胞增殖能力的影响Fig.5 Effect of overexpression LINC00377 on the proliferation of SW579 cells

2.7 过表达LINC00377 明显抑制SW579 细胞的迁移Transwell 迁移实验结果（图6）显示，实验组SW579 细胞穿过底膜的细胞数明显少于对照组［（64.10±11.33）vs.（180.30±24.43）个，P＜0.01］，表明过表达LINC00377 可抑制SW579 细胞的迁移能力。

图6 过表达LINC00377 对SW579 细胞迁移能力的影响Fig.6 Effect of overexpression LINC00377 on the migration of SW579 cells

3 讨论

LncRNA 是非编码家族中的一员，在非编码RNA 中数量最多，广泛表达于人体细胞［6］。LncRNA 本身不具有编码蛋白的能力，长期以来被认为不具有生物学功能，是“转录噪音”［7］。近年来大量的研究［8］发现，LncRNA 广泛参与细胞的各种生物学行为如分化、增殖、衰老、迁移等，在基因转录或转录后水平发挥重要的调控作用。越来越多的LncRNA 如LINC00514、DGCR5、NEAT1、LINC00460 被发现在甲状腺癌的发生中发挥重要作用，通过调控细胞多种分子和信号通路，参与抑制或促进甲状腺癌的进展［9-12］。然而，LncRNA 在甲状腺癌中的研究仍处于初级阶段。LINC00377是一种新发现的LncRNA，其在甲状腺癌中的作用未见报道研究。

本研究通过qRT-PCR 检测显示，LINC00377 在甲状腺癌组织中的表达量相较癌旁组织显著下调，在甲状腺癌中的表达水平相较正常甲状腺滤泡上皮细胞显著下调，表明LINC00377 的低表达可能与甲状腺癌的发生有关。LncRNA 调控基因表达的重要机制之一是“海绵效应”，即通过互补结合下游微小（miRNA），下调下游miRNA 的表达［13］。miRNA 可互补结合下游基因mRNA，具有抑制下游基因表达的作用［14］。LncRNA 通过下调下游miRNA 的表达，进而可上调miRNA 下游mRNA 的表达［15］。通过生物信息技术发现，LINC00377 可互补结合miR-29a-3p，miR-29a-3p 可互补结合含I 型血小板反应蛋白模体的解聚素金属蛋白酶9（ADAMTS9）。研究［16］表明，miR-29a-3p在胃癌组织中呈高表达，可促进胃癌细胞的增殖和上皮间充质转化，发挥原癌基因作用。本研究发现，转染LINC00377 表达质粒可明显下调甲状腺癌细胞中miR-29a-3p 的表达。ADAMTS9基因位于人类染色体3p12-14 区域，是ADAMTS 家族成员之一，与细胞外基质重塑、血管生成、炎症等病理生理过程有关［17］。ADAMTS9已在肝癌、乳腺癌、结直肠癌多种类型的恶性肿瘤中被发现低表达，可通过干扰EGFR∕AKT∕NFκB 通路的激活，抑制肿瘤细胞的增殖和转移，ADAMTS9被确定为抑癌基因［17-18］。本研究发现，转染LINC00377质粒能明显下调甲状腺癌细胞中miR-29a-3p 的表达，miR-29a-3p的低表达可明显上调ADAMTS9基因的表达，提示LINC00377 可能是通过直接靶向负调控miR-29a-3p，间接正向调控ADAMTS9基因的表达的表达，抑制甲状腺癌的发生发展。EGFR∕AKT∕NFκB信号通路与甲状腺的增殖和转移密切相关［19］。ADAMTS9基因表达上调后，EGFR∕AKT∕NFκB 通路蛋白的表达明显降低，提示SW579 细胞增殖和迁移能力降低。本研究进一步通过CCK-8 法和Transwell 迁移实验显示，过表达LINC00377 可抑制甲状腺癌细胞的增殖和迁移。

综上，LINC00377 在甲状腺癌组织和甲状腺癌细胞株呈低表达。在SW579 细胞中，过表达LINC00377 可通过下调miR-29a-3p 的表达，上调ADAMTS9基因的表达，抑制甲状腺癌SW579 细胞的增殖和迁移，为甲状腺癌的诊断标志物研究和靶向治疗提供了参考依据。