活性维生素D拮抗糖尿病胰岛β细胞炎症反应作用机制研究

燕小宁

1.山西中医药大学第四临床学院，山西太原 030619；2.山西省中西医结合医院，山西太原 030001

2 型糖尿病为常见的高发内分泌疾病，其发病机制复杂，至今尚未完全明确。近年来，大量研究证实[1]，2 型糖尿病患者机体存在以巨噬细胞浸润增加为主要特征的胰岛炎症，且对胰岛β 细胞正常功能造成极大影响，进而参与2 型糖尿病的发病及发展，并发挥着重要的作用。临床研究发现[2-3]，活性维生素D 可作为内分泌激素有效调节骨代谢和钙磷平衡，同时还具有免疫调节功能，延缓和防治自身免疫性糖尿病的疾病进展，同时对胰岛组织的炎症反应水平具有明显的抑制作用，可有效改善胰岛组织损伤及淋巴细胞浸润进展；为进一步阐明活性维生素D 拮抗糖尿病炎症反应作用及其作用机制，本研究采用活性维生素D 在体外作用于大鼠胰岛β 细胞RINm 细胞株，观察其对细胞因子引起的胰岛β 细胞凋亡及其受损的胰岛素分泌的影响，并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠胰岛β 细胞RINm 细胞株购自美国ATCC 公司；干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）均购自美国Thermo 公司，活性维生素 D 购自上海罗氏制药有限公司（批号：J20100056）；青链霉素混合液、高糖改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培养基、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰蛋白酶消化液、胎牛血清（CAS：10099-141）购自美国Gibco 公司，4，5-二甲基噻唑-2（MTT）试剂、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自碧云天生物有限公司；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IFN-γ 酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购置美国R&D 公司，一氧化氮（NO）测定试剂盒（酶法）购置南京建成生物研究所。

1.2 方法

（1）细胞培养：RINm 细胞培养于1%青链霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液，在37℃、5% CO2培养箱培养，24h 换液1 次；待细胞增殖至80%融合时，采用0.25%胰蛋白酶消化液消化3min 后，以1mL DMEM 完全培养基终止胰酶消化，并用移液器轻吹打使其解离悬浮，以1 ∶3 比例进行传代。将稳定传代至第4 ～8 代的RINm 细胞接种于96 孔板和6 孔板，培养24h 后，分为4 组，每个样本设3 个复孔；对照组：仅使用10%胎牛血清的DMEM溶液进行培养；在对照组培养基础上，按给药不同分成3 组，VD 组：给予8mol/L 活性维生素D 培养；IL-1β+IFN-γ 组：给予50pg/mL 的IL-1β 和5ng/mL 的LIFN-γ 培养；IL-1β+IFN-γ+VD 组：给予8mol/L 活性维生素D、IL-1β 和5ng/m 的LIFN-γ 培养；各组CO2培养箱避光培养24h 后，进行以下实验。（2） MTT检测：96 孔板培养的RINm 细胞用于MTT 检测细胞增殖抑制率，于各组细胞中加 MTT 试剂 20μL，继续培养4h 后，用移液器吸去培养液，再加DMSO 试剂100μL，低速振荡10min，采用多功能酶标仪于490nm 处检测吸光度，并计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率（%）=（1- 实验孔平均OD 值/对照孔平均OD 值）×100%。（3）相关指标检测 吸取6 孔板培养的RINm 细胞培养液，高速离心取上清液，应用ELISA 法检测上清液中IL-6、TNF-α、IFN-γ 含量，同时以NO 测定试剂盒采用酶法测定上清液中NO 含量，于530nm 处进行检测OD 值，并计算NO 含量（μmol/L）=测定管OD/标准管OD×100μmol/L；所有检测操作严格按试剂说明书执行；（4） 胰岛素水平检测。同上方法得上清液，运用化学发光法，采用全自动化学发光免疫分析仪（德国西门子拜耳公司，型号：ADVIA Centaur）进行含量检测，批间CV 4.1%，批内CV 3.0%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组RINm细胞增殖的影响分析

给予不同试剂培养后，经MTT 试验检测结果显示，VD 组细胞无明显抑制作用（t=1.242，P=0.716）；而IL-1β+IFN-γ 组和IL-1β+IFN-γ+VD 组RINm细胞增殖均受到明显影响（P ＜0.05）；同时，IL-1β+ IFN-γ 组和IL-1β+IFN-γ+VD 组抑制率与VD 组比较均存在显著差异（P ＜0.05）；且IL-1β+IFN-γ 组抑制率较IL-1β+IFN-γ+VD 组显著增高（P ＜0.05），见表1。

2.2 各组RINm细胞炎症指标的影响分析

VD 组RINm 细胞IL-6、TNF-α 及IFN-γ水平与对照组比较，无明显差异（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 组及IL-1β+IFN-γ+VD 组炎症因子水平均显著增高（P ＜0.05）；而IL-1β+IFN-γ+VD组IL-6、TNF-α 及IFN-γ 水平较IL-1β+IFN-γ组显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表2。

表1 各组RINm细胞增殖抑制率比较（）

表1 各组RINm细胞增殖抑制率比较（）

注：t1，P1 为IL-1β+IFN-γ 组 与 对 照 组 比 较；t2，P2 为IL-1β+IFN-γ+VD 组与对照组比较；t3，P3 为IL-1β+IFN-γ 组与VD 组比较；t4，P4 为IL-1β+IFN-γ+VD 组与VD 组比较；t5，P5 为IL-1β+IFN-γ+VD 组与IL-1β+IFN-γ 组比较

组别 OD值 抑制率（%）IL-1β+ IFN-γ组 1.536±0.534abc 47.27±6.84bc IL-1β+IFN-γ+VD组 2.814±0.246ab 23.45±2.15b VD组 3.105±0.084 0.21±0.02对照组 3.338±0.153 -t1 4.351 -P1 0.034 -t2 6.354 -P2 0.027 -t3 5.135 -P3 0.041 -t4 6.075 -P4 0.030 -t5 9.316 -P5 0.010 -

表2 各组RINm细胞IL-6、TNF-α及IFN-γ表达水平比较（

表2 各组RINm细胞IL-6、TNF-α及IFN-γ表达水平比较（

注：t1，P1 为IL-1β+IFN-γ 组 与 对 照 组 比 较；t2，P2 为IL-1β+IFN-γ+VD 组与对照组比较；t3，P3 为IL-1β+IFN-γ 组与IL-1β+IFN-γ+VD 组比较

组别 IL-6（ng/L）TNF-α（ng/L）IFN-γ（pg/mL）IL-1β+IFN-γ组 122.02±18.34 93.79±6.03 49.81±4.47 IL-1β+IFN-γ+VD组 93.07±24.14 68.57±5.98 25.10±2.25 VD组 91.03±25.15 29.86±2.02 18.20±2.05对照组 90.24±26.86 29.84±1.95 15.68±2.29 t1 12.541 23.654 9.648 P1 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 t2 8.654 15.671 6.514 P2 0.031 ＜0.01 0.042 t3 5.625 7.854 4.954 P3 0.034 0.026 0.042

2.3 各组RINm细胞一氧化氮、胰岛素水平分析

VD 组RINm 细胞NO 及胰岛素水平无明显变化（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 组 及IL-1β+IFN-γ+VD组NO 水平显著增高，胰岛素显著降低（P ＜0.05）；IL-1β+IFN-γ+VD 组NO 水平明显低于，胰岛素水平明显高于IL-1β+IFN-γ 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表3。

表3 各组RINm细胞一氧化氮、胰岛素水平比较（）

表3 各组RINm细胞一氧化氮、胰岛素水平比较（）

注：t1，P1 为IL-1β+IFN-γ 组 与 对 照 组 比 较；t2，P2 为IL-1β+IFN-γ+VD 组与对照组比较；t3，P3 为IL-1β+IFN-γ 组与IL-1β+IFN-γ+VD 组比较

组别 NO（μmol/L） 胰岛素（mU/L）IL-1β+IFN-γ组 31.25±2.75 1.17±0.07 IL-1β+IFN-γ+VD组 20.37±1.63 1.54±0.13 VD组 14.54±1.54 1.87±0.14对照组 13.86±2.12 1.82±0.12 t1 15.624 9.561 P1 ＜0.01 ＜0.01 t2 5.627 4.856 P2 0.034 0.041 t3 4.957 6.624 P3 0.034 0.027

3 讨论

统计显示[4]，2 型糖尿病发病率近年来急速上增高，发病年龄亦趋于年轻化。随着糖尿病的发病，易引发肾和心器官、神经血管系统、视网膜等诸多系统并发症的发生，导致器官正常功能损伤和衰竭，甚至致残或致死[5]。目前，大量研究认为糖尿病是一种慢性低度炎症疾病，糖尿病患者细胞因子及趋化因子水平增高、免疫细胞浸润数量增加、胰岛组织淀粉样蛋白沉积等均证实炎症反应与其发病密切相关[6-9]。胰岛β 细胞是引发2 型糖尿病病变的重要细胞，本研究以胰岛β 细胞为研究对象，以探讨其炎症机制。

IL-6 和TNF-α 为重要的炎症因子，并与糖尿病的发病密切相关[10-11]。IL-6 可有效促进超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）、C-反应球蛋白等多种急性时相反应蛋白的合成，诱导炎症及胰岛素抵抗发生[12]；同时，IL-6 对胰岛β 细胞具有一定的细胞毒性，IL-6 水平增高可抑制胰岛β 细胞增殖速度，并诱导凋亡[13]。TNF-α 则可通过抑制胰岛素受体底物-1 表达水平，从而抑制其与胰岛素受体结合，导致胰岛素合成功能降低[14]；另外，TNF-α 还可降低葡萄糖转运4 蛋白的表达水平，直接引发胰岛素抵抗，同时可促进脂质水解，增高游离脂肪酸含量，降低肌细胞糖代谢水平，促进肝糖原合成，间接导致促进胰岛素抵抗的发生；闫镛等[16]发现糖尿病模型大鼠血清TNF-α、IL-6 等炎症因子水平较正常大鼠显著增高，且给予药物治疗后，TNF-α、IL-6 水平呈显著降低。临床研究发现[17]，2 型糖尿病患者血清TNF-α水平与糖化血红蛋白呈正相关，而血清IL-6 水平与空腹血糖值呈正相关，二者对2 型糖尿病的临床疗效及患者预后具有较高的预测价值。并且有大量研究发现[18]，糖尿病及胰岛素抵抗患者血清TNF-α、IL-6 水平较正常人群显著增高，而通过糖尿病治疗和改善胰岛素抵抗后，血清TNF-α、IL-6 水平则呈明显降低。活性维生素D 为2 型糖尿病临床治疗的常用药物，取得了显著疗效，但其作用机制研究报道较少。IFN-γ 为导致β 细胞破坏的代表性Th1 细胞因子，同时本研究联合IL-1β 刺激胰岛β 细胞，在体外建立胰岛炎细胞模型，观察活性维生素D 对大鼠胰岛β 细胞RINm 细胞株的抗炎作用。

本 研 究 结 果 显 示，VD 组RINm 细 胞IL-6、TNF-α 及IFN-γ 水平与对照组比较，无明显差异（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 组 及IL-1β+IFNγ+VD 组炎症因子水平均显著增高（P ＜0.05）；而IL-1β+IFN-γ+VD 组IL-6、TNF-α 及IFN-γ 水平较IL-1β+IFN-γ 组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示IL-1β+IFN-γ 所致的炎症细胞模型成立，活性维生素D 可有效降低胰岛β 细胞IL-6、TNF-α 及IFN-γ 的表达，从而改善细胞炎症水平；同时，对细胞增殖检测结果显示，VD 组细胞无明显抑制作用；而IL-1β+ IFN-γ 组和IL-1β+IFN-γ+VD组RINm 细胞增殖均受到明显影响（P ＜0.05）；同时，IL-1β+IFN-γ 组和IL-1β+IFN-γ+VD 组抑制率与VD 组比较均存在显著差异（P ＜0.05）；且IL-1β+IFN-γ 组抑制率较IL-1β+IFN-γ+VD 组显著增高（P ＜0.05），提示活性维生素D 可有效促进炎症胰岛β 细胞增殖，且对细胞的增殖无抑制作用，安全性高。推测其原因可能为：活性维生素D 作为生理调节剂，可能通过抑制细胞IL-6、TNF-α 等炎症因子的表达，降低炎症因子对胰岛β 细胞的刺激，使细胞增殖不受影响，进而保护胰岛β 细胞正常功能。值得注意的是，胰岛β 细胞正常组亦可检测低水平的IL-6、TNF-α，研究报道显示[19]，低水平IL-6 能有效刺激胰岛β 细胞产生和合成胰岛素，而高浓度IL-6 则会导致胰岛β 细胞产生形态变化和功能障碍。由此推测，低水平炎症因子是维持胰岛β 细胞正常功能的生理需求，而炎症因子水平的增高可抑制其增殖，影响其正常功能。

另外，本研究对胰岛β 细胞的一氧化氮、胰岛素水平检测结果显示，VD 组RINm 细胞NO 及胰岛素水平无明显变化（P ＞0.05）；IL-1β+IFN-γ 组及IL-1β+IFN-γ+VD 组NO 水平显著增高，胰岛素显著降低（P ＜0.05）；IL-1β+IFN-γ+VD 组NO 水平明显低于，胰岛素水平明显高于IL-1β+IFN-γ组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；进一步证实，活性维生素D 可有效改善胰岛β 细胞炎症水平，恢复其正常胰岛素分泌功能；研究发现[20]，活性维生素D具有一定的免疫调节作用，抑制T 细胞介导的免疫反应；IL-6 等Th1 细胞因子协同IL-1β 等单核巨噬细胞因子可诱导胰岛细胞产生炎症过程的级联反应，促进NO 合酶合成过量的NO 及氧自由基，导致胰岛β 细胞内DNA 断裂，进而影响其结构及功能破坏；同时，IL-6、TNF-α 等炎症因子可引起胰岛素抵抗，刺激导致各种细胞因子分泌，降低胰岛素受体的活性，最终导致胰岛素量合成降低；活性维生素D可有效降低IL-6、TNF-α等炎症因子的表达水平，从而改善胰岛β 细胞正常分泌功能。

综上所述，活性维生素D 可有效降低糖尿病胰岛β 细胞炎症反应水平，保护胰岛β 细胞正常分泌功能，为活性维生素D 的临床应用提供参考。