M1型巨噬细胞相关因子在慢性根尖周炎中的表达

丁燕辉, 关宁, 刘乙臻, 高秀秋, 王琳源

(1.锦州医科大学 附属第二医院 牙周黏膜门诊, 辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学 附属第一医院 脑与脊髓损伤重点实验室, 辽宁 锦州 121000)

慢性根尖周炎是一种感染性疾病，多继发于牙髓内的感染，以根尖区的骨质吸收、炎性肉芽组织生成为主要特征，细菌感染、物理刺激和化学刺激以及免疫反应等均可引起慢性根尖周炎，其中定植于感染根管内的细菌可以刺激多种炎症细胞因子的产生，炎症因子进一步引导根尖周的骨质破坏和炎症浸润，它不仅损伤根尖周组织，还与心血管疾病、糖尿病等全身性疾病密切相关[1-3].慢性根尖周病损中存在大量免疫细胞，其中来源于单核细胞的巨噬细胞是根尖周组织中固有免疫细胞的重要成员，不仅能够启动固有免疫反应，而且其抗原加工递呈作用对适应性免疫的启动也非常重要[4-5].现有研究发现P.gingivalis诱导巨噬细胞高表达M1型促炎性细胞因子[6]，在慢性牙周炎患者的病变牙周组织中M1型巨噬细胞相关细胞因子表达高于健康牙周组织[7].与慢性牙周炎相似，慢性根尖周炎作为一种细菌感染性疾病，以炎症和牙槽骨破坏为主要特征.目前有关M1型巨噬细胞相关因子在慢性根尖周炎中的研究国内尚无文献报道.为此，本实验采用逆转录-聚合酶链反应(realtime-PCR,RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)，分别从mRNA水平和蛋白水平检测慢性根尖周病损中M1型巨噬细胞相关因子一氧化氮合酶(iNOS)和信号传导转录激活因子1(STAT1)的表达，探讨M1型巨噬细胞相关因子iNOS、STAT1在慢性根尖周炎发病中的作用, 为根尖周炎的治疗提供新的思路.

1 材料和方法

1.1 实验材料

主要材料如下：Marker(赛默飞公司，美国)；Anti-iNOS antibody ab204017 (ABCAM，英国)；STAT1 Antibody (Cell Signaling，美国)；Rabbit Anti-beta-Actin (Loading Control，Bioss，中国)；BCA蛋白测定试剂盒 (增强型，鼎国昌盛，中国)；聚偏二氟乙烯膜(GE，美国)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 (碧云天，中国)；丽春红染色液(碧云天，中国)；HiScript® II One Step RT-PCR Kit (Vazyme，中国)；100bp DNA Ladder Marker (TaKaRa,中国)；Trizol (ambion,中国)；iNOS引物合成 (鼎国昌盛，中国)；STAT1引物合成 (鼎国昌盛，中国)；焦碳酸二乙酯水(鼎国昌盛，中国).

1.2 样本采集和处理

收集锦州医科大学附属第二医院口腔颌面外科门诊2016年12月至2017年5月依据临床表现和X线片所见诊断为慢性根尖周炎的15例资料，需要进行根尖外科手术或拔除的患牙，取与牙根尖周区相连的病损软组织作为实验组[8-10].收集15例需要拔除的埋伏阻生患牙，取患者阻生牙冠方覆盖的根尖周组织作为对照组.慢性根尖周炎纳入标准：临床检查发现①患牙科探及深龋洞或充填体；②牙冠变色，失去光泽；③叩诊无明显异常或仅有不适感，一般不松动；④有窦型慢性根尖周炎者可查及窦道开口.患者症状：一般无自觉症状，有的患牙可在咀嚼时有不适感，也有因主诉牙龈起脓包而就诊者.影像学结果：X线显示患牙根尖区骨质变化的影像，不同的X线影像提不同的根尖周炎的类型①根尖部透射影圆形，范围较小，直径小于1 cm，边界清晰为根尖周肉芽肿；②根尖区透射影边界不清楚，呈云雾状为根尖周脓肿；③根尖区有一圈致密的白线围绕为根尖周囊肿；④根尖部骨质呈局限性的致密阻射影像为根尖周致密性骨炎.患者排除标准：①患者有系统性疾病；②患牙有牙周病变；③患牙为牙周牙髓联合病变；④过去6个月内服用抗生素或非甾体类抗炎药物.获取标本后用液氮速冻后-80 ℃保存备用.在进行临床试验之前，所有患者签署知情同意书，本研究经锦州医科大学伦理委员会审核批准.

1.3 RT-PCR检测

1.3.1 RNA提取

根据Trizol试剂盒说明书操作.用紫外分光光度计测量RNA质量浓度，测定光密度值，260 nm/280 nm 均在1.8～2.2 ng/μL，记录提取的总RNA质量浓度.操作完成后，冻存于-80 ℃冰箱或直接进行聚合酶链反应(PCR)反应.

1.3.2 RT-PCR反应

按照一步法反转录试剂盒(Vazyme，中国)配置25 μL反应体系，加入反应体系中RNA的量约为300 ng.反转录得到的cDNA进行PCR扩增.引物设计：iNOS引物序列为上游引物序列为5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′，下游引物序列为5′-GGCTGTCAGAGTCTTGTGCCTTTGG-3′，扩增目的基因片段长度为497 bp.STAT1引物序列：上游引物序为5′-AAGCAAGCGTAATCTTCAG-3′，下游引物序列为5′-GGTCTCGTGTTCTCTGTT-3′，扩增目的基因片段长度为298 bp.以β-actin为内参照物，其上游引物序列为5′-AGCGAGC-ATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列为5′-GGG-CACGAAGGCTCATCATT-3′，扩增目的基因片段长度为285 bp,引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成.反应条件为94 ℃，5 min；35个PCR循环(94 ℃，30 s；72 ℃，1 min)；最后72 ℃延伸7 min.PCR产物在质量分数为2%琼脂糖凝胶分离，在凝胶成像系统内扫描后测量谱带强度.

1.3.3 Western Blot检测

取出适量标本，室温融化，加入150 μL裂解液，反复吹打以充分裂解细胞，用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，经蛋白定量后按20 μg/孔行10%聚丙烯酰胺(质量分数为10%SDS-PAGE)电泳并经湿式转膜、洗膜、封闭后，取一抗稀释液(TBST液)按照V抗体∶V抗体稀释液=1∶1 000稀释iNOS，STAT1抗体，4 ℃摇床过夜；洗膜后，再加入按照1∶10 000稀释的二抗，室温振摇孵育2 h，充分洗膜后，用ECL法显色、曝光后测量X线胶片上条带密度.

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 RT-PCR结果

通过RT-PCR比较健康对照组和慢性根尖炎组M1型巨噬细胞相关因子iNOS、STAT1mRNA基因表达的差异.在健康牙龈组织和慢性根尖周炎病损组织中均有不同程度iNOS、STAT1mRNA基因的表达，并且慢性根尖周炎组iNOS、STAT1mRNA基因的表达水平显著高于健康对照组，两组间比较有统计学差异(P<0.05)，图1，表1.

图1 两组中iNOS和STAT1mRNA的表达

Fig.1 Comparison of the mRNA expression of iNOS and STAT1 in healthy control group (N)and chronic periapical periodontitis group (P)

表1 两组中STAT1、iNOS的mRNA表达及比较

组别nSTAT1iNOS健康对照组150.337±0.0720.297±0.055慢性根尖周炎组151.104±0.1901)0.950±0.1781)t值16.70215.952P值0.0000.000

1)与健康对照组相比有统计学差异，P<0.01.

2.2 Western Blot 检测结果

通过Western Blot 检测健康牙龈组织和慢性根尖周炎病损组织iNOS和STAT1蛋白表达情况.在健康牙龈组织和慢性根尖周炎病损组织中均有iNOS和STAT1蛋白表达.与健康对照组相比，慢性根尖周炎组中iNOS和STAT1蛋白表达水平增高，两组间表达量有统计学差异(P<0.001)，图2，表2.

图2 两组中iNOS、STAT1的蛋白表达

表2 两组中STAT1、iNOS的蛋白表达及比较

组别nSTAT1iNOS健康对照组150.260±0.1200.163±0.062慢性根尖周炎组151.001±0.1961)0.913±0.0972)t值16.02227.057P值0.0000.000

1)与健康对照组相比，有统计学差异，P<0.01.

3 讨论

慢性根尖周炎是口腔内科的常见病，表现为炎性肉芽组织的形成和牙槽骨破坏.来自根管系统的细菌感染是慢性根尖周炎主要的致病因素[11].感染根管中的细菌及其毒力因子进入根尖周组织，通过根尖孔刺激宿主炎症反应和免疫机制，产生多种促炎细胞因子[12].在慢性根尖周炎中，炎症反应与多种细胞因子的产生密切相关，慢性根尖周病损中存在大量免疫细胞，可以产生大量的细胞因子,具有较强的致炎作用[13].有研究发现，牙周炎症与巨噬细胞M1和M2表型的增强有关，其中M2向M1的表型转换可能是介导牙周组织损伤包括牙槽骨丢失的重要机制.当M2型巨噬细胞向M1型转换时促炎细胞因子与抗炎细胞因子比值的增强，炎症模式将由保护性向慢性和破坏性方向倾斜.表明M1极化可能是推动牙周炎症发展的关键机制[14].而在本研究中，通过用RT-PCR和Western Blot对M1型巨噬细胞分泌的炎性因子iNOS、STAT1进行检测发现在正常组织中均存在M1型巨噬细胞释放的炎症因子，在慢性根尖周炎的条件下，M1型巨噬细胞炎症因子数量明显增加，表明M1型巨噬细胞炎症因子与慢性根尖周炎的发生息息相关.

iNOS和STAT1是M1型巨噬细胞重要的促炎性细胞因子[15-17]，介导细胞对宿主组织的毒性作用[18-20]，引起炎症反应.其中诱导型iNOS在人慢性炎症中的相关性已被证实[21]，在慢性牙周炎组的病变牙龈组织中iNOS表达显著增加[22-23]，经过治疗后表达降低，提示M1型巨噬细胞可能通过分泌iNOS参与牙周炎发生[24].动物实验也发现牙周炎的条件下，在P.gingivalis刺激下M1型巨噬细胞可通过分泌iNOS促进破骨细胞分化，加重牙槽骨吸收[25-26].在致炎因子的刺激下，iNOS能迅速将精氨酸转化为NO和瓜氨酸，同时伴随产生大量的超氧负离子(O2-)，O2-与NO结合产生过氧硝酸盐(peroxynitrite，ONOO-)，NO会引起血管扩张及血管渗透性增加，NO和ONOO-还会对细胞生存及传导信号的重要的蛋白进行氮化修饰，如细胞因子传导的JAK和STAT蛋白，改变信号途径，直接和间接介导了NO的细胞毒性效应，引发炎症级联反应，将炎症信号波及范围扩大，推动炎症反应[27].STAT1也是一种重要的信号分子，在介导Th1型细胞因子的促炎反应中起重要作用[28].有研究表明，铁能降低IFN-γ诱导的巨噬细胞中STAT1的磷酸化，提示STAT1的抑制可能与减少iNOS和M1型巨噬细胞相关细胞因子的产生有关[29]，这一结果与以前报道的结论一致，即在新生C.neforman感染期间，巨噬细胞中的STAT1信号通路对诱导M1巨噬细胞活化和NO的产生至关重要[30].STAT1被认为是在病原体感染的情况下激活巨噬细胞触发炎症反应的关键[31-32].基于这些研究结果，推测M1型巨噬细胞相关因子iNOS、STAT1可能是参与慢性根尖周炎发病机制的重要炎症细胞因子之一，并且直接参与慢性根尖周炎的发病过程.本研究对M1型巨噬细胞相关因子iNOS、STAT1在慢性根尖周炎中的表达进行了分析，RT-PCR分析显示M1型巨噬细胞中iNOS、STAT1mRNA基因表达明显高于健康对照组.Western Bolt分析显示iNOS、STAT1的蛋白表达明显高于健康对照组，因此，在mRNA和蛋白水平上，iNOS、STAT1在慢性根尖周炎中的表达都比健康对照组的表达更为显著，提示M1型巨噬细胞相关因子存在于慢性根尖周炎病损组织.

另外，体外研究发现M1型巨噬细胞通过分泌白细胞介素2(IL)-12和干扰素γ(IFN-γ)抑制破骨细胞的形成，进而抑制骨吸收[33].在本研究也发现在健康组织中也存在适量的M1型巨噬细胞相关因子STAT1和iNOS的蛋白及mRNA表达，表明巨噬细胞表型平衡在炎症反应中至关重要，适量的炎症细胞对组织起保护作用，但过度分泌可能会破坏机体的免疫平衡，引起炎症反应.由此推测，M1型巨噬细胞可能是免疫的关键，但也同样有助于慢性根尖周炎的炎症.

综上所述，在慢性根尖周炎中M1型巨噬细胞介导的免疫反应增强，提示M1型巨噬细胞参与慢性根尖周炎的发病过程,但M1型巨噬细胞相关因子在慢性根尖周炎中的具体作用机制还有待于进一步研究.