二甲双胍增强人结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

张璐，刘浩，李佳会，王清清，张配

(蚌埠医学院 药学院∥安徽省生化药物工程技术研究中心，安徽 蚌埠 233030)

结肠直肠癌，也称为结肠癌，是全球癌症死亡的主要原因之一，发病率占胃肠道肿瘤的前3位.针对早期结肠癌，目前临床多采取内镜微创治疗[1]，中晚期癌以手术切除及随后的化疗、放疗等传统疗法为主，但效果多不理想.尤其是单一药物治疗，存在不良反应且易产生耐药.20世纪50年代以来，5-氟尿嘧啶(5-FU)一直作为结肠癌治疗的基本化疗药物广泛应用于临床，但由于结肠癌细胞耐药导致的复发和转移[2]，以及对正常细胞毒副作用所致的低耐受性限制了其临床应用[3].因此，寻找高效、低毒的抗肿瘤药物和新的治疗靶点是临床亟待解决的问题.二甲双胍作为治疗2型糖尿病的药物50多年来被广泛使用，并被证明具有潜在的抗肿瘤活性，是一种耐受性良好的药物.此外，二甲双胍与部分化疗药物联合应用时，可以增强化疗药物的敏感性，减少化疗药物的用药剂量，甚至可以逆转某些耐药肿瘤细胞的耐药性[4].关于二甲双胍是否可以增强癌细胞对5-FU的敏感性仍少有报道，且其分子机制尚不详尽.本课题研究了二甲双胍联合5-FU对结肠癌细胞凋亡的影响，初步探讨二甲双胍增强结肠癌细胞对5-FU敏感性的机制，以期为结肠癌新的治疗途径提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人结肠癌细胞系LoVo细胞，购自中科院上海细胞库.

1.1.2 主要试剂

DMEM培养基，购自美国HyClone公司.胎牛血清，购自杭州四季青公司.二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑蓝(MTT)、盐酸二甲双胍, 购自美国Sigma公司.氟尿嘧啶注射液，购自上海旭东海普药液有限公司.胰酶细胞消化液、蛋白裂解液、磷脂结合蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染细胞凋亡检测试剂盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)、线粒体膜电位试剂盒(JC-1)，购自碧云天生物技术有限公司.兔抗人Mcl-1、Bcl-2、Bak、Bax、β-actin抗体，购自美国Proteintech公司.山羊抗兔IgG，购自美国Abbkine公司.Immobilion Western HRP底物显色试剂，购自美国Millipore公司.

1.1.3 仪器

CO2饱和湿度培养箱 3111型，购自美国赛默飞世尔科技公司.正置荧光显微镜DM2500型，德国Leica公司.多功能酶标仪Synerge II型，购自美国BioTex公司.DxP AthenaTM流式细胞仪，购自美国Cytek公司.活细胞工作站Obsever Z1型，购自德国ZEISS公司.蛋白电泳仪Mini-Protena型，购自美国Bio-Rad公司.化学发光凝胶成像分析系统Fluor Chem HD2型，购自美国Alpha Innotech公司.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

LoVo细胞采用含质量分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(以下简称培养液)，在37 ℃、体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱中培养.每24 h对细胞做常规性检查，观察细胞形态和生长情况，2～3 d换一次培养液，根据其生长状态做传代处理，并取对数生长期的LoVo细胞进行实验.

1.2.2 MTT法检测细胞存活率

将含有6×103个LoVo细胞的100 μL单细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，于培养箱中培养24 h后，弃去原培养液，分别加入培养液配制的不同终浓度的二甲双胍溶液(0、1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)和不同质量浓度的5-FU溶液(0、12.5、25、50、100、200 μg/mL)或两者混合溶液，同时设阴性对照组(只含LoVo细胞和培养液)和空白对照组(只含培养液)，每个浓度及质量浓度均设6个平行孔，继续培养24 h、48 h、72 h；然后每孔加15 μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液，培养箱内孵育4 h后,弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置37 ℃培养箱内孵育30 min，酶标仪振板20 s，检测490 nm波长下每孔的光密度，并根据公式计算细胞存活率：

细胞存活率=

1.2.3 联合指数分析药物协同效应

用MTT法测得单药不同药物剂量的抑制率后，可以得到细胞的剂量—效应曲线，通过CompuSyn分析软件计算其联合指数(combination index,CI).联合指数的公式为CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，其中(D)1、(D)2分别为联合用药时两药各自的浓度或质量浓度，Dx为联合用药达到fa时，单药抑制率也达到fa时所需要的药物浓度，Dx=Dm[fa/(1-fa)]-m，fa表示一定浓度及质量浓度的两药联合用药达到的抑制率.通过软件输入单药的剂量及抑制率可得到Dm值和m值，再经上述联合指数计算公式就可得到某种联合用药方案的效应，CI值小于1表示此方案具有协同效应.

1.2.4 集落克隆形成实验检测细胞增殖

将含有5×103个LoVo细胞的2 mL单细胞悬液接种于6孔板.根据MTT结果选择使用明显低于IC50值的浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍和质量浓度为12.5 μg/mL的5-FU 以及两者混合溶液进行此实验.实验设对照组、浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍组、质量浓度为12.5 μg/mL的5-FU组和联合用药组(浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍和质量浓度为12.5 μg/mL的5-FU).24 h后弃去原培养液，加药后37 ℃培养箱中继续培养，显微镜下观察克隆大小，5 d后(大多数单个克隆中细胞数大于50)终止培养.弃培养液，用预冷PBS洗涤2次，每孔加入1 mL体积分数为4%的多聚甲醛于-20 ℃固定10 min；弃固定液，PBS洗涤1次，加1 mL质量分数为0.5%的结晶紫染色液室温染色10 min,去离子水缓慢洗涤数次，室温干燥，数码照相机拍摄，计数克隆数量并计算克隆形成率.

1.2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染检测细胞凋亡

取对数生长期的LoVo细胞制成单细胞悬液，按1×105/孔接种于6孔板.根据MTT结果选择使用接近且不高于IC50值的联合用药组浓度进行后续实验.实验设对照组、浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍组、质量浓度为50 μg/mL的5-FU组和联合用药组(浓度为1.25 mmol/L二甲双胍和质量浓度为50 μg/mL的5-FU).24 h后弃去原培养液，加药后继续培养24 h，然后用不含EDTA的胰酶消化、收集细胞至10 mL离心管，1 000 r/min，离心5～10 min，用PBS洗涤细胞2次，收集(1～5)×105个细胞；加入400 μL Binding Buffer悬浮细胞，置冰浴，各组加入1 μL Annexin V-FITC和1 μL PI于细胞悬液中，室温、避光染色5～15 min，1 h内用流式细胞仪检测，观察凋亡细胞百分比.

1.2.6 JC-1染色检测线粒体膜电位变化

收集LoVo细胞制成单细胞悬液，按1×105/孔接种于6孔板.实验设对照组、浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍组、质量浓度为50 μg/mL的5-FU组和联合用药组(浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍和质量浓度为50 μg/mL的5-FU).24 h后弃去原培养液，加药培养24 h后配置JC-1染色工作液；每孔加入1 mL JC-1染色工作液和1 mL培养液，充分混匀后，37 ℃培养箱中孵育20 min.孵育结束后，吸弃上清，用预冷的JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次.加入2 mL细胞培养液，冰浴保存，荧光显微镜下观察细胞.

1.2.7 Western blot检测相关蛋白表达

将LoVo细胞接种于培养皿中.实验设对照组、浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍组、质量浓度为50 μg/mL的5-FU组和联合用药组(浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍+质量浓度为50 μg/mL的5-FU).待细胞贴壁生长后，弃去原培养液，加药继续培养24 h，然后收集各组细胞：收集悬浮在培养液中的细胞至离心管中，用预冷PBS洗涤1次，胰蛋白酶消化贴壁细胞，待细胞基本脱落后用培养液终止消化，收集细胞至离心管中，将收集的所有细胞于2 500 r/min离心8 min，弃上清，用预冷PBS清洗1次.加蛋白裂解液于冰上裂解30 min，转入1.5 mL离心管，4 ℃、12 000 r/min离心30 min后提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组蛋白质量浓度；并将其稀释至等浓度，与上样缓冲液混合，95 ℃煮沸5 min至蛋白质变性，每组上样量为50 μg.行质量分数为12%的SDS-PAGE电泳分离目的蛋白；冰浴条件下转至PVDF膜.用质量分数为5%的脱脂牛奶室温封闭4 h，稀释后的一抗(V一抗∶V抗体稀释液=1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TPBS洗涤3次，15 min/次；稀释后的二抗(V二抗∶V抗体稀释液=1∶5 000)室温孵育2 h, TPBS洗涤3次，15 min/次.Immobilion Western HRP 底物发光液暗室发光、显影，凝胶成像系统获取图像.采用Image-J软件对目的蛋白和内参蛋白条带进行灰度值扫描，定量分析目的蛋白的表达水平.

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 二甲双胍和5-FU对LoVo细胞存活率的影响

MTT结果显示：实验中使用不同浓度的二甲双胍(0、1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)和不同质量浓度的5-FU(0、12.5、25、50、100、200 μg/mL)处理细胞后，二甲双胍和5-FU均能抑制LoVo细胞的体外增殖活性，且随着药物浓度及质量浓度的增加和作用时间的延长而增强，细胞存活率逐渐降低(P<0.05).浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍与不同质量浓度的5-FU联合干预LoVo细胞后，其24、48和72 h的存活率均低于单用5-FU、二甲双胍组,结果均具有统计学差异(P<0.05)，说明二甲双胍与5-FU联合可增强5-FU对LoVo细胞的增殖抑制作用(图1).

2.2 二甲双胍对5-FU抑制LoVo细胞增殖的协同作用

按照联合用药指数法对MTT原始数据进行分析：采用CompuSyn软件计算联合用药的CI值，结果见图2.从联合指数概念来讲，CI>1 说明药物间为拮抗作用，CI=1 为相加作用，CI<1 为协同作用.CI值越小，表示协同的效应越强.在实际实验中，通常认为CI<0.3 表示强协同效应，0.3

A：不同浓度的二甲双胍干预后LoVo细胞的存活率；B：不同质量浓度的5-FU干预后LoVo细胞的存活率；C：二甲双胍、5-FU联合干预后LoVo细胞的存活率.

A: Viability in LoVo cells treated with metformin at different concentrations; B: Viability in LoVo cells treated with 5-FU at different concentrations; C: Viability in LoVo cells treated with metformin and 5-FU together.

图1 二甲双胍、5-FU及两者合用对LoVo细胞存活率的影响

Fig.1 Effects of metformin and 5-FU, either alone or in combination, on the LoVo cells viability

A:24 h CI; B:48 h CI; C:72 h CI

图2 二甲双胍、5-FU联用组 24 h、48 h、72 h联合作用指数

Fig.2 The combined index after combination treatment of 5-FU and metformin for 24, 48 and 72 h

2.3 二甲双胍和5-FU对LoVo细胞集落克隆形成的影响

细胞集落克隆实验结果显示，单用二甲双胍或5-FU均可抑制LoVo细胞集落克隆的形成，两者合用后对LoVo细胞集落克隆形成的抑制作用更明显，见图3.

表1 二甲双胍联合不同质量浓度的5-FU的CI结果

A：对照组LoVo细胞集落克隆的形成；B：二甲双胍组LoVo细胞集落克隆的形成；C：5-FU组LoVo细胞集落克隆的形成D：联合用药组LoVo细胞集落克隆的形成.1)与对照组比较，P<0.05; 2)与其他3组比较，P<0.05.

A: Colony formation of control group; B: Colony formation of metformin group; C: Colony formation of 5-FU group; D: Colony formation of metformin and 5-FU combination group.1)Compared with control group，P<0.05; 2)Compared with other 3 groups，P<0.05.

图3 二甲双胍、5-FU及两者合用对LoVo细胞集落克隆形成率的影响

Fig.3 Effects of metformin and 5-FU, either alone or in combination, on colony formation of LoVo cells

2.4 二甲双胍对5-FU诱导LoVo细胞凋亡的影响

Annexin Ⅴ-FITC/PI双染后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果如图3所示，对照组、二甲双胍组、5-FU组以及联合用药组24 h LoVo细胞凋亡率分别为(9.02±0.51)%、(11.79±0.39)%、(16.23±0.46)%、(24.38±0.76)%.其中，与对照组比较，其余各组的凋亡率均明显升高(P<0.05)；联合用药组凋亡率明显高于单独用药组(P<0.05).提示：二甲双胍和5-FU均可诱导LoVo细胞凋亡，且联合用药组的 LoVo细胞凋亡更明显.

2.5 二甲双胍联合5-FU对LoVo细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位的下降在荧光显微镜下表现为从红色荧光到绿色荧光的转变.通过JC-1(荧光探针)可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，此转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标.荧光显微镜观察显示：联合用药组红色荧光减弱、绿色荧光增强的程度，较对照组和单独用药组的变化更明显，提示二甲双胍联合5-FU作用于LoVo细胞后，细胞发生了早期凋亡，见图4.

2.6 二甲双胍联合5-FU对诱导的人结肠癌LoVo细胞的凋亡相关蛋白表达影响

Western blot检测Mcl-1、Bcl-2、Bak、Bax蛋白表达的结果显示：与单独用药组比较，联合用药组的抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2的表达下调更明显(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bak、Bax则上调更明显(P<0.05)(图6).提示二甲双胍联合5-FU诱导LoVo细胞的凋亡与下调Mcl-1、Bcl-2和上调Bak、Bax有关.

1)与对照组比较，P<0.05; 2)与其他3组比较,P<0.05.

图5 二甲双胍、5-FU及两者合用对LoVo细胞线粒体膜电位的影响(×200)

1)与对照组比较，P<0.05; 2)与其他3组比较,P<0.05.

3 讨论

回顾性病例对照研究发现，2型糖尿病患者的结肠癌发病率明显高于非糖尿病患者，说明2型糖尿病与包括结肠癌在内的某些癌症的高风险密切相关[5-6].而在使用一线药物二甲双胍治疗糖尿病的人群中，胃肠道恶性肿瘤的发病率较低[7]，且患有结肠癌的2型糖尿病患者的总生存率提高了40%[8].因此二甲双胍对癌细胞的凋亡作用越来越受到医学界的关注.现今，联合不同机制的抗肿瘤药物[9]，降低毒副作用和延缓耐药产生是治疗肿瘤的有效手段；进一步研究显示二甲双胍和部分抗肿瘤药物联合作用时，可以增强化疗药物的敏感性，但其机制尚不明确.本实验观察了浓度为1.25 mmol/L的二甲双胍与不同质量浓度的5-FU联合干预LoVo细胞后，其24、48和72 h的存活率均低于5-FU组、二甲双胍组，说明联合用药组对LoVo细胞的增殖抑制作用更强；联合用药指数法分析MTT数据得出24、48和72 h两药联合作用指数CI<0.7，提示二甲双胍对5-FU抑制LoVo细胞增殖的作用有中、强度协同增敏作用.Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞术检测二甲双胍联合5-FU对LoVo细胞凋亡影响的结果表明联合用药组的早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于单独用药组.

线粒体跨膜电位下降可作为细胞早期凋亡的标志性事件[10]，主要源于线粒体内膜的通透性增加[11]：线粒体生成了由多个蛋白质组成的位于线粒体内外膜接触位点的动态的通透性转变孔道[12](PT孔道).JC-1是广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针[13]，通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化.当线粒体膜电位较高时，JC-1主要以红色荧光聚集体存在于线粒体基质中；线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，而主要以绿色荧光单体形式存在.从红色荧光到绿色荧光的转变提示线粒体跨膜电位的下降.本研究的JC-1检测结果发现，二甲双胍与5-FU的联合用药组红色荧光减弱、绿色荧光增强的程度更明显，说明联合用药组LoVo细胞的凋亡更明显.

线粒体是细胞进行有氧呼吸的中枢，是细胞凋亡调控的核心部位.Bcl-2蛋白家族主要定位于线粒体和内质网膜上[14]，是线粒体凋亡途径和细胞周期调控的关键调节因子[15].根据同源性基序(BH)和功能,其可分为抗凋亡蛋白(BH1-BH4)、促凋亡蛋白(BH1-BH3)和促凋亡BH3-only蛋白[16].正常细胞中，抗凋亡蛋白(Bcl-2、Mcl-1)和促凋亡蛋白(Bak、Bax)存在相互作用，可控制MOMP[17](线粒体外膜透化作用)；在细胞接收凋亡刺激后，Bcl-2[18]、Mcl-1等抗凋亡蛋白与BH3-only蛋白结合而失活，促使Bak、Bax等促凋亡蛋白释放[19-20]，这些促凋亡蛋白通过同源寡聚化在线粒体外膜上形成PT孔道并释放细胞色素c，从而引起半胱天冬酶级联反应[21]，最终导致细胞凋亡.在许多人类肿瘤如胃肠道肿瘤(结肠癌等)中，存在Bcl-2、Mcl-1过度表达的现象，而高表达的Bcl-2、Mcl-1可抑制细胞凋亡[22-23].因此Bcl-2、Mcl-1、Bak、Bax 在线粒体介导细胞凋亡中发挥着至关重要的作用.为了进一步阐明凋亡分子机制，本研究发现，与单独用药组比较，联合用药组的抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表达的下调更明显，而促凋亡蛋白Bak、Bax的上调更明显，提示二甲双胍促进5-FU诱导的LoVo细胞凋亡与下调Mcl-1、Bcl-2和上调Bak、Bax有关.

综上所述，本研究证实了二甲双胍对人结肠癌细胞的增殖抑制作用，并且能够明显增强5-FU诱导结肠癌细胞凋亡的作用.其机制可能与下调Mcl-1、Bcl-2和上调Bak、Bax的表达有关，但其具体机制有待深入探讨.