高胆红素血症新生儿血红蛋白A、F与G-6-PD表达的相关性

赖苑双，黎维丹，胡向国，查显丰

(暨南大学 附属第一医院 临床检验中心，广东 广州 510630)

新生儿高胆红素血症(neonatal hyperbilirubinemia，NHB)是儿科的常见疾病，发生率为健康足月儿的66.7%，约占住院新生儿疾病总发生率的40%[1-2].NHB由多种病理因素引起, 严重者可引起不同程度的脑损伤,导致核黄疸, 若未及时治疗，可引发胆红素脑病甚至危及生命[3-5].

临床上新生儿由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)缺乏引起的溶血性黄疸的发病率特别高，广东地区是G-6-PD缺乏症的高发区[6].新生儿高胆红素血症的病因主要是红细胞破坏过多，导致红细胞数下降以及血中胆红素浓度的升高.新生儿机体通过造血代偿，可能会导致血红蛋白A(HbA)增高和胎儿血红蛋白F(HbF)减少.HbF是胎儿期的主要血红蛋白，出生后由HbA所替代，已有文献报道胎儿出生后HbF水平及消失方式[7].但目前国内有关新生儿高胆红素血症与新生儿G-6-PD及HbF表达的相关性鲜有研究.探明新生儿高胆红素血症与新生儿G-6-PD及HbF表达的相关性，可为高胆红素血症患儿提供有意义的临床资料，对高胆红血症的诊断有一定的临床指导意义.

本研究通过对2014年1月至2018年10月暨南大学附属第一医院住院的新生儿高胆红素血症病例进行初步回顾性研究与描述性分析，以期探讨新生儿高胆红素血症与Hb、HbF及G-6-PD浓度的相关性及其临床意义.

1 对象与方法

1.1 研究对象

全部资料来自2014年1月至2018年10月在暨南大学附属第一医院进行了血红蛋白电泳及G-6-PD筛查的新生儿2 932例，其中男1 614例、女1 318例，日龄<28 d，中位日龄为4 d.总胆红素浓度、血红蛋白电泳、血红蛋白质量浓度(Hb)、G-6-PD活性检测结果由暨南大学附属第一医院检验科提供.

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂与仪器

胆红素及G-6-PD的检测，采用日本产日立7600型全自动生化分析仪.胆红素测定试剂为日本和光纯药工业株式会社生产的钒酸氧化法胆红素测定试剂盒，G-6-PD定量测定试剂盒购自广州科方生物技术有限公司.血红蛋白电泳采用法国SEBIA公司生产的SEBIA-MINICAP毛细管电泳仪，试剂盒购自SEBIA公司.

1.2.2 高胆红素血症诊断标准

参照《实用新生儿学》和新生儿黄疸干预推荐方案的新生儿高胆红素血症的诊断标准，总胆红素浓度>153 μmol/L，72 h后总胆红素浓度>205 μmol/L，早产儿总胆红素浓度>255 μmol/L，均以间接胆红素升高为主，符合以上标准者诊断为高胆红素血症[8-10].

1.3 测定方法及原理

1.3.1 胆红素浓度的测定

利用钒酸氧化法测定总胆红素(total bilirubin,TBIL)浓度.在表面活性剂和化学氧化剂的存在下，pH值3.0附近, 表面活性剂和钒酸将血清中的TBIL在一定时间内氧化成胆绿素，此时胆红素所呈的黄色减少.反应前后的光密度差与TBIL浓度成正比.在450 nm波长下测定氧化剂加入前后的光密度之差，定量求得血清中TBIL的浓度.

1.3.2 G-6-PD的检测

操作按照试剂盒说明书进行，分别测定红细胞中G-6-PD与6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6-PGD)的活性，A液用于测定G-6-PD活性，B液用于测定6-PGD活性，两者分别在不同的通道内测定.反应原理均为催化其相应的底物反应，同时将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP)还原为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide Phosphate,NADPH)，通过监测340nm处光密度上升的速率即可计算两者的活性，再计算两者的比值，G-6-PD/6-PGD<1.0即确诊为G-6-PD 缺乏症.G-6-PD/6-PGD≤0.6为重度缺乏，G-6-PD/6-PGD<1.0 为中度缺乏，G-6-PD/6-PGD>1.1为正常.

1.3.3 血红蛋白HbA和HbF质量浓度的检测

采用血红蛋白毛细管电泳法，由于血红蛋白中的各组分其分子表面所带电荷性质与数量不同而等电点各异.在不同pH的电场中，因其所带电荷差异而泳动速度不同.由此可将血红蛋白的各组分HbA和HbF分开.根据电泳图谱的峰面积计算出HbA和HbF的百分比，然后乘以血红蛋白的质量浓度(Hb)，从而得到HbA和HbF的质量浓度.

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 住院新生儿高胆红素血症及G-6-PD缺乏的发病率

本研究统计了2 932例住院新生儿，高胆红素血症的发病率为72.7%，其中男性新生儿的发病率为72.4%，女性新生儿为73.1%，提示高胆红素血症是住院新生儿的主要疾病.

2 932例新生儿中共有292例患儿G-6-PD缺乏，患病率为10.0%，其中重度缺乏占7.4%，中度缺乏占2.6%；男性新生儿G-6-PD缺乏为197人，占6.7%，其中重度缺乏190例，占6.5%，中度缺乏7例，占0.2%；女性新生儿为95人，占3.2%，其中重度缺乏27列，占0.9%，中度缺乏68例，占2.3%；男性新生儿G-6-PD缺乏患病率是女性新生儿的2倍.

2.2 新生儿高胆红素血症发病与G-6-PD缺乏之间的相关性

G-6-PD缺乏是导致新生儿高胆红素血症的原因之一，一旦发病，病程一般进展较快[11]，为此本实验根据G-6-PD酶活性对其缺乏程度进行分组，将住院新生儿分为G-6-PD重度缺乏组、G-6-PD中度缺乏组和正常新生儿组3组，观察不同G-6-PD缺乏其血清TBIL浓度，结果显示G-6-PD重度缺乏新生儿血清TBIL浓度(245.0±126.9)μmol/L明显高于正常新生儿血清TBIL浓度(224.1±114.0)μmol/L(P=0.016 2)，而G-6-PD中度缺乏新生儿血清TBIL浓度(217.5±126.7)μmol/L与G-6-PD重度缺乏新生儿和正常新生儿之间血清TBIL浓度无统计学差异(P=0.098 9，P=0.657 0，图1).

图1 G-6-PD缺乏患儿与正常新生儿血清胆红素的浓度

G-6-PD缺乏是不是一定能够导致高胆红素血症呢？进一步观察G-6-PD缺乏患儿高胆红素血症的发病情况，结果显示G-6-PD缺乏的292例新生儿中高胆红素血症为223例(占76.4%),其中G-6-PD重度缺乏合并高胆红素血症有172例(占5.8%)，G-6-PD中度缺乏合并高胆红素血症有51例(占1.7%)，2 640例G-6-PD正常对照组中高胆红素血症有1 908例(占72.3%)，3组之间无明显统计学差异(2=5.782，P=0.055)，因此还不能说明G-6-PD缺乏是引起新生儿高胆红素血症的一个主要原因.同时，本实验对性别不同新生儿的G-6-PD缺乏者的高胆红素血症患病情况进行分析，发现新生儿G-6-PD缺乏者合并高胆红素血症男性(155例，占5.3%)发病率明显高于女性(68例，占2.3%).

2.3 高胆红素血症患儿与正常新生儿Hb和HbF质量浓度的比较

新生儿胆红素增高主要是由红细胞破坏增多引起的，因此观察高胆红素血症患儿的Hb质量浓度及其组分HbF和HbA是否发生变化.研究发现高胆红素血症组Hb质量浓度(162.9±22.2)g/L明显低于正常新生儿组Hb质量浓度(165.1±22.5)g/L(P<0.000 1)，高胆红素血症患儿其组分HbF质量浓度(132.2±22.8)g/L明显低于胆红素正常组其组分HbF质量浓度(137.0±26.1)g/L(P<0.000 1)，而HbA质量浓度(30.4±10.2)g/L则明显高于胆红素正常组的HbA质量浓度(27.5±12.6)g/L(P<0.000 1,图2).

进一步将高胆红素血症组和正常组根据G-6-PD缺乏程度分成总胆红素正常且G-6-PD正常组(TBIL-G6PD-)、总胆红素正常而G-6-PD缺乏组(TBIL-G6PD+)、高胆红素血症而G-6-PD正常组(TBIL+G6PD-)和高胆红素血症合并G-6-PD缺乏组(TBIL+G6PD+)，分析G-6-PD缺乏对Hb及其组分影响.结果发现无论在高胆红素血症还是TBIL正常组中G-6-PD正常新生儿的Hb质量浓度(164.1±21.8)、(166.0±22.6)g/L和HbF质量浓度(134.1±22.6)、(138.0±26.3)g/L都明显高于G-6-PD缺乏症新生儿的Hb质量浓度(152.9±22.7)、(155.7±19.4)g/L和HbF质量浓度(121.6±22.1)、(126.9±22.9)g/L(P<0.000 1，P<0.000 1；P=0.000 3，P=0.000 7)，而HbA质量浓度在G-6-PD正常组与G-6-PD缺乏组之间都无统计学差异(P=0.409 7，P=0.710 4，图3).

图2 高胆红素血症患儿Hb、HbF和HbA的质量浓度比较

图3 G-6-PD缺乏和正常的高胆红素血症新生儿的Hb、HbA和HbF的质量浓度

3 讨论

新生儿高胆红素血症是指由于疾病或某些致病因素所引起血清胆红素超过生理性黄疸的诊断标准, 亦称为病理性黄疸, 是新生儿时期的常见病[12].本研究中新生儿高胆红素血症的发病率为72.7%.引起新生儿高胆红素血症的机制主要包括胆红素产生增加(如ABO血型不符、G-6-PD 缺乏症和血肿等)导致红细胞破坏增多和胆红素排泄减少(如早产儿葡萄糖醛酸转移酶活性低，肝炎，胆道闭锁)等所导致.

G-6-PD 缺乏症是X 染色体连锁不完全显性遗传的一种红细胞酶缺陷病，是引起血清胆红素增高的一个潜在因素.G-6-PD 缺乏时, 由于红细胞内磷酸戊糖代谢受阻，NADPH 及谷胱甘肽(glutathione, GSH)生成不足，细胞代谢过程中生成的过氧化氢毒性未能及时清除而受影响, 在临床上主要表现为先天性非球形红细胞性溶血,即在无诱因的情况下出现慢性溶血[13].本研究发现在我院住院新生儿G-6-PD 缺乏具有很高的发病率，约10.0%，与文献报道的广东地区G-6-PD缺乏发病率大体一致[14]，其中男性新生儿检测出G-6-PD 缺乏者比率是女性新生儿的2倍左右,原因跟X 染色体连锁不完全显性遗传有关.G-6-PD缺乏症是不是引起新生儿高胆红素血症的主要因素呢？本实验分析了G-6-PD 缺乏的住院新生儿高胆红素血症患病率，发现G-6-PD 缺乏的新生儿高胆红素血症总的患病率(76.4%)未明显高于G-6-PD正常患儿(72.3%), 提示G-6-PD酶活性跟新生儿高胆红素血症的发生没有直接的相关性.这是由于G-6-PD酶缺乏症患者只有在某些诱因如药物、感染、食物、围产等因素的作用下才会引起急性溶血, 红细胞大量破坏, 胆红素产生过量和葡萄糖醛转移酶发育不成熟而引起肝细胞摄取胆红血素能力不足, 形成胆红素能力低下、排泄胆红素功能不成熟, 致使非结合胆红素潴留血液而发生黄疸[15].因此，G-6-PD 缺乏者并不一定就会发生新生儿高胆红素血症，但在诱因存在的情况下G-6-PD酶缺乏可能是引起新生儿高胆红素血症的一个病因，其中，由于G-6-PD 缺乏症X 染色体连锁不完全显性遗传病，男性属于半合子，缺乏程度为重度，而女性多数为杂合子，少数为纯合子，缺乏程度较轻，所以男性新生儿G-6-PD缺乏者更容易诱发新生儿黄疸，一旦发病，要对症处理，因此对新生儿应进行常规的G-6-PD酶活性的检查，及早采取预防措施，控制诱因，可大大减少该病的发生[16].此外，研究还发现在G-6-PD重度缺乏新生儿中，尽管TBIL浓度增高未达到诊断新生儿高胆红素血症的标准，但是血清TBIL的浓度还是明显高于正常新生儿，提示G-6-PD重度缺乏新生儿机体内存在轻微的红细胞被破坏.

新生儿出生血红蛋白的主要成分是胎儿血红蛋白HbF(α2γ2)，胎儿出生后机体在基因转录水平上, 胎儿γ-基因停止了转录, 而成人β-基因转录水平明显增加, 与此相应的 HbF 转换为成人型 HbA(α2β2)[17].高胆红素血症主要是由红细胞破坏引起的，所以对高胆红素血症新生儿的血红蛋白及其组分和HbF进行分析，探讨高胆红素血症患儿的血红蛋白及其组分HbA和HbF有没有发生改变.实验发现高胆红素血症组Hb和HbF质量浓度明显低于胆红素正常组，而HbA的质量浓度明显高于胆红素正常组.导致这一变化的原因可能是新生儿高胆红素血症体内由于红细胞破坏过多导致红细胞数下降，新生儿机体会通过造血代偿，刺激了红细胞加速由γ链的合成转换为β链的合成，从而导致HbA合成增高和胎儿HbF减少.进一步分析发现无论在胆红素正常新生儿还是高胆红素血症患儿中，G-6-PD缺乏者Hb和HbF的质量浓度都明显低于G-6-PD正常者，而HbA质量浓度则没有显著差异，显示在没有诱因的情况下G-6-PD缺乏患儿体内红细胞还是会发生破坏或者红细胞破坏的速率较正常新生儿要高，而机体代偿性合成HbA的质量浓度却未明显增加，从而导致新生儿贫血.

综上所述，本研究通过分析了住院新生儿G-6-PD酶活性与新生儿高胆红素血症发病的关系，发现G-6-PD酶缺乏并不是引起G-6-PD酶缺乏高发区住院新生儿高胆红素血症发病的主要原因；同时首次观察了高胆红素血症新生儿的Hb及其组分HbA和HbF的表达情况，发现高胆红素血症新生儿的Hb及其组分HbF质量浓度明显降低，HbA质量浓度则明显增加，这些结果为全面了解新生儿高胆红素血症的病理生理提供基础数据，也提示通过血红蛋白电泳检测Hb及其组分HbA和HbF可能对新生儿高胆红素血症的诊断和治疗有一定的临床意义.