黄芪对铅损伤大鼠脑组织抗氧化能力影响的研究

尹晓婷，高伟超，李彦萱，张 珂，赵浩堂，周雅蕊，赖亚辉，孙维琦

（北华大学医学院，吉林 吉林 132013）

铅是一种高毒性重金属，目前广泛应用于现代工业生产。铅被人体摄入后，以离子形式进入血液循环，通过血脑屏障进入脑[1]，临床常见患者出现注意力障碍、记忆力丧失等症状[2]。铅暴露对脑功能的影响还具有远期效应，可以增加包括阿尔兹海默病在内的多种神经退行性疾病的发病率[3]。铅损伤中枢神经系统的最主要机制究是氧化应激损伤[4]，然而黄芪的药理学研究发现黄芪可以抗氧化改善学习记忆能力[5]。但关于黄芪抗铅损伤的研究目前国内还鲜有研究，因此本实验在建立大鼠铅损伤的模型上进行不同浓度黄芪抗铅损伤的研究，为临床铅损伤造成的学习记忆力障碍临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD雄性大鼠40只，大鼠体质量180～2 20 g，购于吉林大学医学实验动物中心，基础饲料喂养，自由饮食、饮水。

1.1.2 药品 黄芪颗粒黄芪颗粒（免煎型）由华润三九医药股份有限公司提供，每包1 g，相当于生药10 g，批号1103171S，GMP认证。

1.1.3 试剂及仪器 考马斯亮蓝法蛋白定量测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、一氧化氮（NO）测定试剂盒、胆碱酯酶（CHE）测试盒、谷胱甘肽过氧化无酶（GSH-Px）测试盒均购于南京建成生物工程研究所；醋酸铅溶液1 g/L购于辽宁泉瑞试剂有限公司；TM-100 Morris水迷宫仪器（成都泰盟技术有限责任公司）；TAS-990AFG型原子吸收分光光度计（普析通用）。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 将40只SD大鼠随机分成5组，每组8只。分别为正常对照组、铅损伤模型组、铅损伤黄芪颗粒高、中、低剂量组。正常对照组大鼠自由据结果以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪颗粒对铅损伤大鼠学习记忆能力的影响 定位航行实验中，铅损伤模型组大鼠的平均逃避潜伏期、饮用蒸馏水；铅损伤模型组、铅损伤黄芪高、中、低剂量组自由饮用浓度为1 g/L的醋酸铅溶液共4周，铅损伤黄芪颗粒干预组按 3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg 剂量，加入蒸馏水制备混悬液灌胃；正常对照组、铅损伤模型组灌胃等容量生理盐水。每6 d称1次体质量，调整灌胃量，1次/d，连续4周。

1.2.2 Morris水迷宫测试 时间为7 d （每日上午8：30—12：00）。该实验分为两部分，1）定位航行实验：将小鼠置于水迷宫的房间适应0.5 h，每只小鼠每天均训练1次，在平台的对面，面向池壁将小鼠放入水中，记录小鼠的逃避潜伏期；在120 s内还未找到平台，并记录逃避潜伏期为60 s。最后都让小鼠在平台停留15 s。2）空间探索实验：训练第6天将平台撤出，入水点不变，把小鼠放入水中120 s，测量目标象限滞留时间、游泳路程及速度。

1.2.3 大鼠标本处理 用啮齿动物专用断头器断头处死大鼠，取大脑制成10%的脑组织匀浆，在温度4℃下，3500 r/min离心15 min，收集上清液待测。同时完成取右侧股骨操作，将股骨上肉剔除干净后剪成碎段放入带有编号的小烧杯中备用。

1.2.4 指标检测 按照试剂盒步骤检测大鼠脑中胆碱酯酶（CHE）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）含量。 蛋白定量采用考马斯亮蓝法。原子吸收石墨炉法检测骨铅含量。

1.3 统计学方法 通过SPSS 22.0软件进行统计，数运动距离长于正常组（P＜0.05），铅损伤模型组与黄芪颗粒剂量组大鼠的平均逃避潜伏期、运动距离对比，随黄芪剂量增加而缩短（P＜0.05）；在空间探索实验中，铅损模型组大鼠的滞留时间和穿越次数均少于正常组（P＜0.05），铅损伤模型组与黄芪剂量组大鼠的滞留时间和穿越次数随黄芪剂量增加而逐渐增多（P＜0.05）。结果见表1。

2.2 黄芪颗粒对铅损伤大鼠脑组织中抗氧化能力的影响 模型组的MDA含量高于正常对照组MDA含量，差异有统计学意义（P＜0.05），低、中、高剂量黄芪颗粒干预组与模型组对比MDA明显降低，并随剂量增加而明显降低，有统计学意义（P＜0.05）；模型组的SOD水平低于正常对照组SOD水平，模型组与正常对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05），低、中、高剂量黄芪颗粒干预组与模型组对比SOD明显增高，并随剂量增加而明显增加，有统计学意义（P＜0.05）；模型组的CHE活力低于正常对照组CHE水平，造模组与正常对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05），低、中、高剂量黄芪颗粒干预组与模型组对比CHE明显增高，并随剂量增加而明显增加，有统计学意义（P＜0.05）；正常对照组和模型组大鼠脑组织中GSH-Px相较，模型组明显降低有统计学意义（P＜0.05），造模组和黄芪颗粒低、中、高干预组对比没有统计学意义（P＞0.05）；模型组NO含量高于其它4组NO含量，差异有统计学意义（P＜0.05），低、中、高剂量黄芪颗粒干预组与模型组对比NO明显降低，并随剂量增加而明显降低，有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。

表1 黄芪对铅损伤大鼠空间学习记忆能力的影响（±s， n = 8）

表1 黄芪对铅损伤大鼠空间学习记忆能力的影响（±s， n = 8）

注：与正常对照组比较，# P＜0.05；与低剂量黄芪组比较，△P＜0.05；与中剂量黄芪组比较，▲P＜0.05；与高剂量黄芪组比较，□P＜0.05

组 别 定位航行实验 空间探索实验潜伏期/s 运动距离/m 滞留时间/s 穿越次数/次正常对照组 30.427±4.669 8.717±2.320 16.800±4.201 13.500±3.338黄芪低剂量组 39.721±4.520 11.465±5.240 10.871±2.621 11.714±3.251黄芪中剂量组 37.300±3.323 11.980±4.176 13.671±3.992 11.857±3.132黄芪高剂量组 34.725±6.091 9.361±2.019 16.713±3.392 13.875±1.885铅损伤模型组 42.585±4.632#△▲□ 11.980±4.299#△▲□ 11.756±3.740#△▲□ 7.889±3.444#△▲□

表2 黄芪对铅损伤大鼠大脑中MDA、SOD、CHE、GSH-Px、NO的影响（±s， n = 8）

表2 黄芪对铅损伤大鼠大脑中MDA、SOD、CHE、GSH-Px、NO的影响（±s， n = 8）

注：与正常对照组比较，# P＜0.05；与低剂量黄芪组比较，△P＜0.05；与中剂量黄芪组比较，▲P＜0.05；与高剂量黄芪组比较，□P＜0.05

组 别 MDA/（nmol/mg） SOD/（U/mg） CHE/（U/mg） GSH-Px/（μmol/L） NO/（μmol/g）正常对照组 0.265±0.127 13.699±2.995 5.716±2.506 5.121±1.785 0.886±0.789黄芪剂量组 0.550±0.294 11.351±1.133 5.471±1.328 3.919±1.008 1.223±0.481黄芪中剂量组 0.421±0.381 11.277±2.045 4.323±1.192 3.571±1.722 1.065±0.642黄芪高剂量组 0.370±0.134 10.994±1.519 4.638±1.188 3.885±1.199 0.991±0.714铅损伤模型组 0.665±0.395#△▲□ 10.609±2.069#△▲□ 5.630±3.088#△▲□ 3.656±0.704#△▲□ 2.135±1.014#△▲□

2.3 黄芪对铅损伤大鼠骨铅检测结果 铅损伤模型组的骨铅含量显著高于正常对照组（P＜0.05），低、中、高剂量黄芪颗粒干预组与模型组对比骨铅含量明显下降，并随剂量增加而明显降低，有统计学意义（P＜0.05）。结果见表3。

3 小结

黄芪是一味具有补气益气功效的中药，《神农本草经》中记载：“黄芪，味甘，性微温，归肺、脾、肝、肾经。”中医认为，黄芪具有补虚补阳、疏肝解郁、利尿消肿之功效。现代药理学证明黄芪主要化学成分是黄芪多糖、黄芪皂苷、黄酮类、氨基酸、微量元素等，具有增强免疫系统功能、调节血压、抗肿瘤、抗衰老等作用[6]。铅是日常生活中常见的重金属污染物,主要通过饮食摄入、皮肤接触和气体交换三个途径进入机体并蓄积，继而在机体中产生毒性损伤。中枢神经系统是机体铅损伤最为敏感的主要靶器官之一，同样也是受损最为严重的系统，损伤中枢神经系统后临床常见顽固性头痛、精神迟钝和注意力障碍、记忆力丧失等症状，儿童较成人更容易被损伤，临床症状更加明显[7]。

表3 各组大鼠骨铅水平测定结果（±s ，n = 8）

表3 各组大鼠骨铅水平测定结果（±s ，n = 8）

注：与正常对照组比较，# P＜0.05；与低剂量黄芪组比较，△P＜0.05；与中剂量黄芪组比较，▲P＜0.05；与高剂量黄芪组比较，□P＜0.05

组 别 骨铅含量/（μg/g）正常对照组 13.469±4.029低剂量组 29.960±4.503中剂量组 24.267±6.155高剂量组 23.792±8.062铅损伤模型组 42.116±12.389#△▲□

学习记忆障碍作为铅损伤损伤后的常见的临床症状，被医学界广泛研究与重视，Morris水迷宫是一种通过强迫实验动物游泳来学习寻找隐藏于水中的平台的操作过程, 是目前世界公认的较客观的评价学习记忆功能方法[8]。本实验研究表明铅损伤大鼠在黄芪颗粒的干预下定位航行和空间探索有明显的改善，提高了大鼠的学习记忆能力。本研究还发现黄芪颗粒有促进铅在机体内代谢的作用，大鼠体内的骨铅在黄芪颗粒干预下可明显降低。

铅在大脑中的氧化应激损伤途径主要包括两个方面，一是使脑中氧自由基产量增多，另一个就是影响脑中的抗氧化过程[9]。抗氧化应激包括酶抗氧化系统和非酶抗氧化系统两大方面。SOD、CHE、GSH-Px是机体内清除氧自由基的重要酶类，能够使超氧化物阴离子转变为HO和氧分子，从而保护细胞膜，防止细胞破坏。铅损伤大鼠大脑时引起SOD、CHE、GSHPx活性下降，大量氧自由基产生，导致脑组织损伤。本实验结果也证实铅损伤模型组SOD、CHE、GSH-Px活性明显下降，铅损伤下脑组织清除氧自由基的能力下降；通过黄芪颗粒干预后SOD、CHE活性明显升高，表明黄芪颗粒能够提高SOD、CHE的活性，清除氧自由基，但对GSH-Px活性影响不明显。MDA是脂质过氧化物的终产物，它能够使细胞突变、衰老、死亡、生物膜变性或坏死。因此，检测MDA含量能够间接反应细胞损伤的程度。本实验结果表明铅损伤模型组MDA含量明显增加，经黄芪颗粒干预后MDA含量明显下降，提示黄芪颗粒能够抑制脂质过氧化反应，保护脑组织。铅蓄积影响一氧化氮合酶（NOS）的活力，催化产生NO，激发诱导细胞氧化应激损伤，引发神经细胞凋亡，影响学习记忆功能[10]，吴立蓉等通过研究黄芪对Ⅱ型糖尿病大鼠抗氧化能力的影响发现，黄芪可以增强糖尿病大鼠的抗氧化作用并抑制糖尿病大鼠血清NO/NOS水平[11]，本实验结果表明铅损伤模型组NO含量明显增加，经黄芪颗粒干预后NO含量明显下降，黄芪拮抗了铅损伤造成的脑内NO增高造成的氧化应激，提高学习记忆能力。大量的研究发现黄芪在抗氧化应激方面有多方面积极效应，黄芪可以减轻自由基对脑细胞DNA的损伤，维护海马区神经细胞的结构完整性，改善或延迟脑组织和神经元退行性变[12]，还可以通过减少Ros（reactive oxygen species）的释放和激活抗氧化剂元素[13]，抑制氧化应激介导的凋亡[14]，恢复线粒体功能障碍和氧化应激引起的形态学改变[15]。

综上所述，黄芪颗粒对铅损伤后大鼠脑组织中抗氧化作用有显著影响，能明显提高铅损伤后大鼠学习记忆能力，其机制可能是通过拮抗脑内氧化应激，具体拮抗途径还有待于研究。虽然黄芪抗氧化作用的研究很多，但针对于黄芪拮抗铅损伤的基础实验较少，希望本实验能为黄芪拮抗铅损伤作用提供有用的实验依据。