芪参活骨片提取工艺和制剂成型工艺优选研究

北京市鼓楼中医医院（100009）徐阳 耿嘉玮 葛永潮

北京中医药学会（100005）王春生

芪参活骨方为来源于北京市鼓楼中医医院的临床经验方，具有补脾益气，补肾壮骨，化瘀通络的功效，主要成分有炙黄芪、党参、骨碎补、鹿角胶等，其中黄芪为补气之要药，益气化阳，骨碎补补肾健骨，活血续伤，为君药。该方临床上主要用于髋部疼痛、屈伸不利、腰膝酸软等症的股骨头坏死患者。临床有多年使用历史，安全有效[1]。现拟将该复方制成片剂，以利于提高药物稳定性，便于患者服用、贮存及携带[2]。本研究以芪参活骨方中君药的有效成分，即黄芪苷及柚皮苷的含量为标准，进行工艺研究，通过正交试验、单因素试验等，对相关参数进行优选，最终确定了芪参活骨片的最佳制备工艺[3]。

1 材料

1.1 仪器 高效液相（SPD-20A型，日本岛津），UV-VIS检测器；高效液相（Agilent1100，美国Agilent公司），蒸发光散射检测器（2000ES，Alltech公司）；电子天平（BT125D型，d=0.01mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；电子调温电热套（DZTW型，北京中仪泓瑞科技发展有限公司）。

1.2 对照品、药材与试剂 黄芪甲苷（中国药品生物制品检定所，批号：110781-201314）；柚皮苷（中国药品生物制品检定所，批号：110722-201613）。

炙黄芪（北京太洋树康饮片厂，批号：20170201），骨碎补（北京太洋树康饮片厂，批号：1704090）。

乙腈（色谱纯，Fisher公司）；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；纯净水（娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）；甲醇、冰醋酸等其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷的含量测定方法的建立 参考2015年版中华人民共和国药典[4]方法测定，采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量。

2.1.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-水(32∶68)，流速为1.0mL·min-1，柱温为25℃；蒸发光散射检测器检测（ELSD）参数：漂移管温度105℃，载气（压缩空气）流速2.7L·min-1。进样量：对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定黄芪甲苷对照品，加甲醇制成0.503mg·mL的溶液。

附表1 正交试验因素水平表

附表2 提取工艺正交试验结果

附表3 黄芪甲苷提取率方差分析表

附表4 柚皮苷提取率方差分析表

附表 5 验证试验（n=3）

附表 6 相对密度考察

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称定炙黄芪药材粉3份，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇150mL称定重量，超声处理45min，取出，称重，补重，滤过，取100mL备用；重复上述提取操作，合并两次的正丁醇液共200mL，用氨试液充分洗涤2次，每次50mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容，即得黄芪药材供试品溶液，依法测定黄芪甲苷的含量。

按处方比例称取炙黄芪、党参和骨碎补等9味药材，加水煎煮，滤液滤过，浓缩或稀释至1000mL容量瓶中，摇匀，精密量取250mL药液，离心除去不溶于水的杂质，将离心后的上清液浓缩至25mL，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，萃取液用氨试液洗涤2次，每次50mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，用甲醇复溶，定容至5mL容量瓶中，摇匀，过0.22μm微孔滤膜吸取滤液，即得（黄芪甲苷）供试品溶液，依法测定其中黄芪甲苷的含量。

2.2 柚皮苷的含量测定 参考2015年版中华人民共和国药典[4]方法测定，采用HPLC法测定柚皮苷的含量。

2.2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇-醋酸-水（35∶4∶65)；检测波长283nm，流速1.0mL·min-1，进样量10μl，理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定柚皮苷对照品，加甲醇制成60.4μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称定骨碎补粗粉3份，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30mL，称定重量。加热回流3小时，放冷，再称重，补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得骨碎补药材供试品溶液。依法测定其中柚皮苷的含量。

按处方比例称取炙黄芪、党参和骨碎补等9味药材，加水煎煮，过滤，量取滤液体积，过0.22μm微孔滤膜吸取滤液，即得（柚皮苷）供试品溶液。依法测定其中柚皮苷的含量。

2.3 提取工艺优选 根据处方中各药味有效成分的理化性质，确定方中炙黄芪、党参和骨碎补等9味药采用水提醇沉法提取。本试验以黄芪中黄芪甲苷含量和骨碎补中柚皮苷含量为指标成分，对该9味药的最佳水提醇沉工艺参数进行研究。

2.3.1 水提工艺优选 试验采用正交设计，以黄芪甲苷提取率和柚皮苷提取率为指标，以加水倍量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为影响因素，每个因素选取3水平，用L9（34）表安排试验（见附表1）。按处方比例称取药材，平行称量9份，结果见附表2。黄芪甲苷提取率和柚皮苷提取率的方差分析见附表3、4。

附表 7 醇沉浓度考察

附表 8 醇沉浓度验证

附表 9 辅料种类考察

附表 10 乙醇浓度及药辅比的考察

附表 11 压片工艺考察

结果：直观分析可知，以黄芪甲苷为指标时，三因素对黄芪甲苷提取率结果影响的大小顺序为A＞C＞B，从各因素水平分析，A为K3＞K1＞K2，B为K2＞K3＞K1，C为K2＞K3＞K1，方差分析结果显示加水倍量对黄芪甲苷提取率有显著性差异，提取时间、提取次数对黄芪甲苷提取率无显著性差异，故选择的最优提取工艺为A3B2C2；以柚皮苷为指标时，三因素对柚皮苷提取率结果影响的大小顺序为C＞A＞B，从各因素水平分析，A为K3＞K2＞K1，B为K1＞K3＞K2，C为K3＞K2＞K1，方差分析结果显示加水倍量、提取时间、提取次数三因素对柚皮苷提取率均无显著性差异，故选择的最优提取工艺为A3B1C3。黄芪为方中君药，而黄芪甲苷为黄芪主要有效成分，并且考虑到实际生产过程中的原料损耗和人力问题，最终以黄芪甲苷提取率为依据，选择A3B2C2为最佳提取工艺，即加水12倍、提取1.5小时、提取2次。

2.3.2 验证试验 为验证该提取工艺条件的合理性，对A3B2C2进行3批验证试验。称取处方量饮片，按优选条件进行试验，结果见附表5。结果 显示，黄芪甲苷的提取率为86.83%、柚皮苷的提取率为79.23%，由此说明该工艺的条件合理、稳定可行，因此，确定A3B2C2作为最优的提取工艺。

2.3.3 醇沉工艺参数优化 以黄芪甲苷、柚皮苷转移率为指标，考察醇沉相对密度和醇沉浓度。

2.3.3.1 药液浓缩相对密度考察 将按照最佳水提工艺制备药液，提取的液分4份，每份1000mL，其中3份分别减压浓缩至相对密度为1.05～1.10（60℃）、1.10～1.15（60℃）、1.15～1.20（60℃）的清膏，加入适量95%乙醇使醇浓度达60%，4℃静置12h，取上清液，并记录体积，按供试品制备方法分别制备供试品。以黄芪甲苷、柚皮苷转移率为指标，确定最佳药液浓缩相对密度（结果见附表6）。

结果分析：直观分析黄芪甲苷和柚皮苷的转移率可以得到醇沉时最佳的相对密度为1.05～1.10（60℃），在此条件下黄芪甲苷和柚皮苷均有较高的保留率，故确定最佳醇沉相对密度为1.50～1.10（60℃）。

2.3.3.2 药液醇沉浓度考察 同法制得3份体积相同的水提液，减压浓缩至上述最优相对密度，即1.10～1.15（60 ℃），加入适量95%乙醇使醇浓度分别达50%、60%、70%，4℃静置12 h，取上清液，并记录体积，以黄芪甲苷、柚皮苷转移率为指标，确定最佳药液醇沉浓度，结果见附表7。

结果分析：在相对密度为1.05～1.10（60 ℃），醇沉浓度为50%时，黄芪甲苷和柚皮苷均有较高的保留率，故确定最佳醇沉工艺为相对密度1.05～1.10（60℃），醇沉浓度为50%。

2.3.4 验证试验 为验证该醇沉条件的合理性，按处方比例称取药材适量，以最优工艺进行提取，分别取3份相同体积的提取液，浓缩至1. 05～1.10（60℃），加95%乙醇使醇浓度达50%，进行3批验证试验，结果见附表8。

结果显示，该条件下黄芪甲苷和柚皮苷的转移率分别为91.91%、96.56%，该工艺条件合理、稳定可行。

综合以上研究结果，确定芪参活骨片的水提醇沉工艺为：饮片加12倍量水，每次1.5小时，提取2次，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.05～1.10（60 ℃），加乙醇至醇浓度为50%。

3 成型工艺研究

3.1 制粒方法考察

3.1.1 湿润剂的选择 湿法制粒常用的润湿剂为乙醇，故选择乙醇为润湿剂，并考察不同乙醇浓度对制粒情况的影响。

3.1.2 辅料种类的选择 综合考虑药粉、辅料性质及经济因素，初步选定糊精、乳糖、可溶性淀粉三种辅料，将浸膏粉与糊精、乳糖、可溶性淀粉分别按1∶1的比例混合均匀，喷入95%乙醇制粒，以颗粒成型率、软材性状、制粒难易程度及颗粒的色泽、细粉、粘结情况等为评价指标，优选辅料种类，结果见附表9。

结果可知，辅料选择乳糖时颗粒的制粒较为容易，成型率较高，软材性状适宜。因此选择乳糖为填充剂制粒。

3.1.3 辅料用量及润湿剂乙醇浓度的优选 提取纯化工艺研究中，1000个制剂单位的干膏粉量为438g，每片约0.438g。实际生产中片剂片重最大0.6g，为病人最大耐受。试验选择药辅比为3∶1、5∶1、7∶1进行制粒。将适量干膏粉与乳糖分别按3∶1、5∶1、7∶1的比例混合均匀，分别喷浓度为85%、90%、95%的乙醇制粒，以颗粒成型率、软材性状、制粒难易程度及颗粒的色泽、细粉、粘结情况等为评价指标，结果见附表10。

结果分析：由附表10可知，乙醇浓度为95%时，软材较为松散，细粉较多，成型率不高，当乙醇浓度为90%时成型率有所改善，而当乙醇浓度为85%时，软材易形成较硬团块，过筛困难。对比药辅比例不同时颗粒的成型率及制粒难易程度则发现，药辅比为3∶1时制粒较为容易，成型率较高。因此选择90%乙醇为润湿剂，药辅比为3∶1进行制粒。

3.2 压片工艺考察 实验中发现，由上述实验优选出的工艺即乳糖∶干膏粉=3∶1，润湿剂为90%乙醇制粒、压片后所得片剂崩解时限不达标准，因此需加入适量的崩解剂。羧甲基淀粉钠（CMS-Na）作为优良的崩解剂，广泛应用于片剂的制备工艺。试验将进一步考察CMS-Na压片的处方用量。

按照乳糖∶干膏粉=3∶1，乳糖和CMS-Na分别按2∶1、1∶1、1∶2的比例混合均匀，润湿剂为90%乙醇的方法制粒、压片。以片剂的硬度和崩解时限为考察指标，进一步确定最优处方工艺，结果见附表11。

结果：片剂的硬度与乳糖和CMS-Na的比例关系不大，但片剂的崩解时限随着随着CMS-Na用量的增大而缩短，当乳糖∶CMS-Na比例为1∶1、1∶2时片剂的崩解时限均符合要求，考虑到节约成本，最终选择乳糖∶CMS-Na比例为1∶1作为最佳压片工艺的辅料配比。

通过上述试验确定芪参活骨片的成型工艺为：90%乙醇为润湿剂，以乳糖为填充剂，CMS-Na为崩解剂，辅料比为干膏粉∶乳糖∶CMS-Na=3∶1∶1，制备颗粒，加入适量助流剂硬脂酸镁，压片，即得。

4 讨论

提取方式的选择，处方中各药物所含活性成分理化性质有较大差异，炙黄芪、党参、骨碎补和土鳖虫等的有效成分在水中溶解度较大，为最大程度富集有效成分，故设计水提醇沉工艺路线[5]。本实验通过实验确立了芪参活骨片中水提醇沉工艺和制片工艺的一系列参数，为工业化生产提供了有效的数据支持。

指标成分的选择，黄芪，补气养血；骨碎补，补肾强骨，续伤止痛，在芪参补骨片中起重要治疗作用，黄芪甲苷可抗炎镇痛、柚皮苷促进骨髓细胞增殖，并且这两种活性成分性质稳定且含量较高，以其为考察指标有利于保证提取工艺与成品制剂在药效学上的一致性。

中药浸膏粉一般具有较强吸湿性，需加入适当的辅料降低吸湿性便于制粒。乳糖性质稳定，有良好的可压性、流动性和干黏合性，本实验选定乳糖∶浸膏粉=1∶3的用量，为芪参活骨片大生产提供了参考。在制粒过程中，润湿剂乙醇的体积分数不适时，易发生软材发黏而堵塞筛网的现象或者制得的颗粒细粉较多，颗粒成型率低的现象。CMS-Na为常用崩解剂，加入少量既可起崩解剂作用又可使制得的片剂有适宜的硬度和较快的溶出速度。少量助流剂可改善颗粒流动性，可保证片重差异较小。

按优选出的工艺验证制备的片剂成形性、硬度适宜，抗湿性良好，且外观完整美观，达到大生产要求，为生产提供了可靠依据。