HPLC法同时测定银翘解毒丸（水蜜丸）中5种成分的研究

北京市昌平区食品药品安全监控中心（102200）范宇佳

北京市昌平区食品药品监督管理局（102200）徐立民 张爱华

银翘解毒丸处方源于银翘散，银翘散出自我国清代著名医家吴瑭所著的《温病条辨》一书[1]，演变于金元四大医学家之一李东垣的清心凉膈散。原文记载的本方药物组成为“银花一两，连翘一两，苦桔梗六钱，薄荷六钱，竹叶四钱，生甘草五钱，荆芥穗四钱，淡豆豉五钱，牛蒡子六钱，用鲜芦根汤煎煮后服用”。主要用于治疗流行性感冒、上呼吸道感染、急性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、疱疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾病[2]，也有用于手足口病、艾滋病等治疗的文献报道[3][4]。

附表1 5种成分线性关系

附表2 5种成分加样回收率试验结果（n=6）

附表3 5种成分含量测定结果（mg/g）

作为我国中药传统剂型口服散剂的银翘散，虽然具有吸收快、起效快等特点，但也存在服用量大、服用次数多，不便于服用等缺点。目前国内由银翘散为处方改制的中成药品种有26个，其中银翘解毒丸、银翘解毒片是应用最为广泛的原方改剂品种，是治疗风热感冒的常用中成药，该药疗效稳定，临床应用广泛。

银翘解毒丸（水蜜丸）收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册[5]，该标准中通过显微鉴别、薄层色谱定性检测金银花、桔梗、连翘、牛蒡子、荆芥、薄荷、甘草七种中药材，无定量检测项目。对其质量控制的研究报道，主要集中在以HPLC测定其中的绿原酸、牛蒡子苷、连翘苷等单个成分的含量[6-9]。本实验采用高效液相色谱（HPLC）方法，同时测定银翘解毒丸（水蜜丸）中绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷和甘草酸等特征性成分的含量，该方法简单、高效，可有效控制质量，确保临床疗效。

附图 5种成分HPLC色谱图。1：绿原酸；2：甘草苷；3：连翘苷；4：牛蒡苷；5：甘草酸

1 仪器

XS205DU电子天平（0.01mg，美国梅特勒公司）；KQ-500DV 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（配置在线真空脱气装置、四元梯度泵、自动进样器、柱恒温箱、SPD-20A紫外检测器，日本岛津公司）。

2 试药

绿原酸（含量96.6%，批号110753-201314）、连翘苷（含量95.3%，批号110821-201213）、牛蒡苷（含量95.7%，批号110819-201309）、甘草苷（含量93.7%，批号111610-201106）、甘草酸铵（含量92.6%，批号110731-201317）对照品均购自中国食品药品检定研究院；银翘解毒丸（水蜜丸）（每100粒重10g）购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Fisher Scientific公司）；水为超纯水。

3 方法与结果

3.1色谱条件 ThermoC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相A为乙腈，B为0.5%磷酸，梯度洗脱（0～8min，5%A；8～12min，5%→15%A；12～30min，15%A；30～50min，15%→40%A；50～60min，40%→60%A；60～70min，60%→100%A；70～80min，100%→5%A），体积流量0.8mL/min；检测波长230nm；柱温25℃；进样量供试品溶液10μL，对照品溶液5μL。

3.2对照品溶液制备 精密称取连翘苷对照品5.42mg置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成连翘苷对照品贮备液；再分别精密称取绿原酸对照品8.14mg，牛蒡苷对照品10.12mg，甘草苷对照品2.51mg，甘草酸铵对照品7.91mg置同一50mL量瓶中，并精密加入上述连翘苷对照品贮备液1mL，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含绿原酸0.1573mg，连翘苷0.0103mg，牛蒡苷0.1937mg，甘草苷0.0470mg，甘草酸0.1435mg（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）的混合对照品溶液。

3.3供试品溶液制备 取银翘解毒丸（水蜜丸）适量，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过（0.45μm微孔滤膜），取续滤液作为供试品溶液。

3.4阴性样品溶液制备 按银翘解毒丸（水蜜丸）处方及工艺，制备金银花阴性样品、连翘阴性样品、牛蒡子阴性样品和甘草阴性样品，再按“3.3”项下方法分别制备金银花阴性供试品溶液、连翘阴性供试品溶液、牛蒡子阴性供试品溶液和甘草阴性供试品溶液。

3.5系统适用性试验 精密吸取“3.2”～“3.4”项下溶液适量，在“3.1”项色谱条件下测定，结果见附图。由附图可知，各成分分离度均大于1.5，理论塔板数均大于30000，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

3.6线性关系考察 取“3.2”项下对照品溶液，按“3.1”色谱条件分别进样1、2、4、6、8、10、12μL，测定。以对照品溶液的进样体积（μL）为横坐标（x），各对照品色谱峰面积为纵坐标（y）进行回归，结果见附表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

3.7精密度试验 精密吸取供试品溶液10μL，在“3.1”项色谱条件下测定，重复进样6次，测定峰面积，计算绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.05%、0.47%、0.08%、0.36%、0.15%，表明仪器的精密度良好。

3.8重复性试验 取样品（批号12031242）6份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下测定，测得绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸含量的RSD分别为0.34%、1.48%、0.28%、1.20%、1.78%，表明该方法的重复性良好。

3.9稳定性试验 取样品（批号12031242）1份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、10 h后，在“3.1”项色谱条件下测定，测得绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.12%、0.53%、0.20%、0.11%、1.73%，表明供试品溶液在室温下10h内稳定。

3.10加样回收率试验 精密称取已知含量的银翘解毒丸（批号12031242）6份，每份取0.50g，置于具塞锥形瓶中，精密加入“3.2”项下混合对照品溶液2ml，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下测定，计算加样回收率，结果见附表2。

3.11样品含量测定 取3批样品，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下测定，结果见附表3。

4 讨论

4.1流动相选择 在流动相的选择上，选取乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液等溶剂系统，分别测定同一供试品溶液中5种被测成分的峰面积。在乙腈-0.5%磷酸溶液流动相系统，梯度洗脱的色谱条件下，绿原酸、牛蒡苷、连翘苷、甘草苷和甘草酸分离效果良好，峰形较好，在60min 内就能实现良好的分离。确定乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相系统。

4.2检测波长选择 在检测波长的选择上，取5种被检测成分绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷和甘草酸（以甘草酸铵计）的对照品，分别加甲醇配制成对照品溶液，在200～400nm波长范围内扫描测定紫外吸收光谱，测得各成分的最大吸收波长，通过分析比较，选取230nm、250nm、280nm作为备选检测波长。在备选检测波长下分别测定同一供试品溶液中5种被测成分的峰面积。为保证5种被测成分均有较大吸收，确定检测波长为230nm。

4.3柱温选择 分别考察了25℃、30℃、40℃柱温时对样品峰形、保留时间、分离度的影响，最终选择25℃作为最佳柱温。

5 结论

该实验采用HPLC法同时测定银翘解毒丸（水蜜丸）中绿原酸、连翘苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸含量的方法，操作简便、专属性强、结果可靠，能快速、直观和全面地反映银翘解毒丸（水蜜丸）内在质量，可应用于银翘解毒丸（水蜜丸）的质量控制及生产过程质量控制。