大鼠体内百草枯组织分布研究

李鹏飞 范家明 刘 河 张 茜 安卓玲 刘丽宏

(首都医科大学附属北京朝阳医院药事部, 北京 100020)

百草枯(paraquat，PQ)又称对草快、克芜踪，属联吡啶杂环化合物，为速效触杀型、灭生性季胺盐类除草剂，在我国农林行业广泛使用，目前尚无替代品[1]。百草枯对人毒性极大，且无特效药，口服中毒病死率可达90%以上，百草枯可导致肝、肾等多器官衰竭，肺部不可逆纤维化和呼吸衰竭[2-3]。百草枯的致毒机制目前尚未阐明，研究[4]显示百草枯是一电子受体，吸收入体后通过一系列作用引起细胞内超氧化阴离子自由基及过氧化氢过量，引起组织器官细胞膜脂质过氧化，从而造成多系统组织器官的损害。百草枯在人体的毒代动力学尚不清楚。初步的毒代动力学研究[5-6]显示，百草枯可经皮肤、呼吸道和消化道不完全吸收，随血液分布至全身各组织器官，肺中含量较高，达到血中含量的十至数十倍。百草枯在体内很少降解，常以完整的原形物随粪、尿排出，少量可经乳汁排出。研究[7-9]显示，百草枯血浆质量浓度仅能间接反映百草枯体内情况，并不能代表受损伤器官中毒物浓度，研究中应重点关注各靶器官的损伤和器官衰竭情况。本研究采用高效液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)测定方法，系统性研究了染毒下百草枯在大鼠体内多个组织中的分布情况，为百草枯毒性机制的进一步研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD大鼠，雄性，体质量220～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 仪器与试剂

5500 QTRAP型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(electrospray ionization，ESI)以及Analyst 1.6数据处理软件，美国Sciex公司；岛津20A高效液相色谱系统，包括液相泵、自动进样器、柱温箱等，日本岛津公司。BP211D型十万分之一分析天平，德国Sartorius公司。Direct 8型Milli-Q超纯水系统，美国密理博公司。百草枯对照品，含量为99.8%，批号：856177-250 MG，百草枯-d8对照品，含量为98.0%，批号：50636-5 MG，均购自美国Sigma公司。其他试剂均为色谱均，超纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

1.3 百草枯组织样本LC-MS/MS测定方法建立

1.3.1 溶液的配制

校正曲线和质控样本的配制：精密称取10 mg百草枯对照品，加入对应体积的乙腈-水(1∶1)溶解并涡旋，配制1 g/L的百草枯储备液。精密量取百草枯储备液，用空白组织匀浆提取液逐级稀释至校正曲线样本所需浓度1、2、5、10、20、50、100 μg/L。重新称量并配制质控用储备液，精密量取并用空白组织匀浆提取液逐级稀释至质控样本所需浓度 3、15、80 μg/L。内标溶液的配制：精密称取10 mg百草枯-d8对照品，加入乙腈-水(1∶1)充分溶解，配制成1 g/L的内标储备液。取适量内标储备液用乙腈逐级稀释至100 μg/L的百草枯-d8内标溶液。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Waters Acclaim Trinity Q1色谱柱(3.0 mm×50.0 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水[100 mmol/L甲酸铵、0.4%(体积分数)甲酸]，流速：0.8 μL/min(1∶1分流)，梯度洗脱(表1)；进样量：10 μL。

表1 梯度条件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.3 质谱条件

离子源： ESI，正离子模式；离子喷射电压：5 500 V；温度：550 ℃；鞘气压力：379.2 kPa；雾化气压力：379.2 kPa；气帘气压力：158 kPa；碰撞气压力设为Medium；以上气体均使用高纯氮气；扫描方式为多重反应监测。百草枯和百草枯-d8解簇电压：50 V、140 V；碰撞能量：16 eV、15 eV；百草枯和百草枯-d8定量分析的离子对分别为质谱比(m/z)93.1→171.1和m/z97.1→179.2，百草枯用于定性考察的离子对为m/z186.1→171.1。

1.4 大鼠实验设计及组织样本采集

大鼠饲养于清洁动物房内，所有的实验操作均符合首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心实验动物管理委员会的要求，温度为(22±2) ℃，相对湿度为23%。实验前12 h禁食不禁水。

雄性大鼠36只，采用数字表法随机分为9组，每组4只。9个组分别为给药前组、给药后0.5、1、3、6、10、24、48、72 h组，给药前组不给予百草枯，直接处死取组织；给药后组单次灌胃给予90 mg/kg百草枯，分别于对应时间点处死大鼠，处死前取血浆，处死后分别取心、肝、肺、肾、大脑、小脑、胃组织。每个时间点各组织用0.9%(质量分数)氯化钠注射液洗净，放入-70 ℃冰箱中冰冻待处理。

大鼠处死前通过眼眶取血约0.4 mL，置于含肝素的EP管中，立即以13 200 r/min离心10 min分离血浆，放入-70 ℃冰箱中冰冻待测。

1.5 组织样本处理方法

剪取并称量组织(0.250±0.025)g，若组织少于0.25 g，全部取用，记录全部重量。注意取组织不同部位各一小部分，例如，不同肝叶、双肾等。加入500 μL乙腈-水(1∶1)，使用匀浆机匀浆2～8 min(根据实际需要，不同组织匀浆时间可适当调整)，组织匀浆液涡流振荡20 min，在4 ℃下13 200 r/min离心5 min，组织匀浆上清液倒入另一1.5 mL EP管中，-70 ℃冰冻待测。

向1.5 mL EP管中加入组织匀浆上清液样本100 μL，加入内标溶液100 μL，加入乙腈200 μL，涡流2 min后在4 ℃下13 200 r/min离心10 min，取150 μL上清液进行LC-MS/MS分析，进样10 μL。

1.6 各组织和血浆中百草枯浓度LC-MS/MS测定方法

本研究前期建立了血浆中百草枯浓度的定量检测方法，并按照9012《生物样品定量分析方法指导原则》[10]进行全面方法学验证，验证通过后采用建立的方法进行大鼠不同剂量染毒后毒代动力学研究[11]。除基质不同外，7种组织提取液的样本前处理方法、液相条件、质谱参数与血浆检测质谱方法完全相同。组织样本检测时标准曲线、质控样本均采用对应空白组织匀浆提取液配制，与组织样本完全一致。研究中仅对每种组织样本进行了部分方法学验证，分别进行了连续2 d、每天4个浓度水平质控样品的准确度和精密度考察。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 质控样品准确度与精密度

所有质控样品准确度为88.03%～112.73%，精密度为10.14%，方法的准确度和精密度达到生物样品分析要求。

2.2 大鼠基本情况

大鼠灌胃百草枯染毒后出现活动明显减少，毛发易脱落，饮水、饮食减少等现象。大鼠灌胃百草枯染毒后体质量随时间降低明显，72 h处置组体质量降幅最大，降幅为给药前体质量的13.21%。除按处置时间处死取样外，36只大鼠均无染毒死亡现象。

2.3 组织分布结果

大鼠灌胃百草枯染毒后组织，其中胃、肾、肺和肝的达峰质量浓度均>30 μg/g，心、大脑和小脑的达峰质量浓度均<10 μg/g。胃和肺1 h浓度最高，分别为(205.5±69.5)μg/g、(35.5±28.0)μg/g；肾和肝3 h浓度最高，分别为(124.8±146.9)μg/g、(30.9±42.1)μg/g。各组织和血浆大多数浓度点个体间变异超过50%，呈现较高的个体差异，详见表2。不同组织是同一时间点浓度差异的影响因素(P<0.01)，除肝、肾、大脑和小脑外，不同时间是同一组织浓度差异的影响因素(P<0.05)。同一组织或同一时间内两两比较，大多数组织间比较或时间点间比较均差异有统计学意义(P<0.05)。

Tissue and plasmaSampling times/h0.513610244872F2P2Stomach/(μg·g-1)198.3±42.3205.5±69.5150.2±77.641.5±8.231.1±10.830.6±16.56.0±2.02.4±1.218.31< 0.001Kidney/(ng·g-1)54.1±12.843.8±11.8124.8±146.919.6±8.717.9±5.620.4±10.39.0±6.93.6±3.12.250.065Lung/(ng·g-1)29.4±20.335.5±28.013.4±12.510.1±7.89.1±2.79.2±1.56.1±4.54.9±1.62.850.026Liver/(ng·g-1)17.1±9.911.1±5.630.9±42.110.1±6.83.7±1.05.9±4.71.9±0.80.8±0.31.620.179Plasma/(ng·g-1)10.41±10.083.41±1.142.07±1.061.54±1.581.34±1.600.93±0.650.47±0.300.11±0.073.290.01Heart/(μg·g-1)8.8±2.68.7±3.87.5±5.13.7±1.72.8±1.24.7±1.32.9±2.12.2±1.04.160.004Brain/(μg·g-1)5.3±7.21.5±0.91.3±1.70.5±0.21.2±0.72.4±2.40.3±0.10.9±0.41.330.279Cerebellum/(μg·g-1)0.8±1.01.6±0.71.3±0.81.2±0.41.5±1.01.2±0.31.2±0.21.8±0.40.890.532F156.75629.1094.41126.97023.8908.8803.8804.360--P1< 0.001< 0.0010.002< 0.001< 0.001< 0.0010.0060.004--

F1,P1: repeated measures ANOVA;F2,P2: one way ANOVA.

大鼠百草枯染毒后组织及血浆浓度柱状分布见图1，浓度-时间曲线见图2，百草枯在大鼠胃中分布的浓度是在各个脏器中最高的，达峰较快。大鼠的肾、肺和肝也是百草枯分布较多的脏器，其中肾脏中的浓度高于肺中的浓度，但达峰时间比肺慢。百草枯在肾脏中浓度较高，急性肾损伤也是百草枯中毒后常见症状。心脏、大脑和小脑中百草枯也有一定分布，浓度最大值为1.6～8.8 μg/g，且大脑中分布较快、心脏排出缓慢。百草枯体内分布状况与其中毒后靶器官损伤部位及程度高度一致，除大脑48 h外，7种组织24～72 h中组织质量浓度均大于血浆毒物浓度，其中胃、肾、肺和肝中百草枯的质量浓度远高于血浆浓度。

图1 大鼠百草枯染毒后组织及血浆浓度图Fig.1 Tissue and plasma concentration in rats exposed to paraquatA：higher peak mass concentration；B：lower peak mass concentration.

图2 大鼠百草枯染毒后组织及血浆毒物浓度-时间曲线Fig.2 Concentration-time profile of tissue and plasma concentration in rats exposed to paraquat

3 讨论

毒物组织分布研究的前提是建立精准的目标物定量方法，百草枯的质谱定量在离子对和色谱柱的选择上均需要深入探索和优化。百草枯为季胺盐，本身带两个电荷，质谱中最常见的准分子离子峰为m/z93.1，但在转移过程或离子源中，也可能失去一个电荷，准分子离子峰为186.1，经碰撞后失去一个CH3+形成子离子m/z171.2。百草枯的极性很强，在普通的C18柱子上无法或很难保留，本研究选用的Acclaim trinity Q1色谱柱是专用于高极性化合物的百草枯专用色谱柱，在百草枯的分离和峰形上有便优异的效果。样本测试中百草枯组织浓度极高，超过定量上限的组织样本需经空白组织提取液稀释后进行复测。在匀浆过程中要多次逐级清洗匀浆机，防止交叉污染；先匀浆所有空白样本，根据百草枯体内浓度特点，组织匀浆按时间点“后前”顺序匀浆；高浓度的肝、肺、肾、胃组织最后匀浆。

毒性研究应尽可能采用与临床相同的给予途径和剂型，以便比较不同种属动物的全身暴露情况。由于百草枯是易中毒毒物，临床实践中无给药途径，实际急救中中毒患者均为一次性口服误入、皮肤黏染、肺吸入，以口服误入为最常见，且百草枯口服误入中毒几乎很少有多次染毒情况，因此本研究选用最常见的一次性灌胃给予毒物。我国自2016年7月1日停止百草枯水剂在国内销售和使用[12]，临床上中毒多数为百草枯胶剂或胶剂稀释液中毒，本研究中使用百草枯胶剂稀释至所需浓度后灌胃给予大鼠。大鼠急性给予百草枯半数致死量(median lethal dose, LD50)为150 mg/kg，研究选用90 mg/kg剂量进行试验。

本研究中除按处置时间处死取样外，36只大鼠均无染毒死亡现象，与本研究室开展的大鼠体内的百草枯毒代动力学研究90 mg/kg剂量下病死率有极大的差异[6]，推测由于药代动力学研究中需要在给予毒物当天密集采血11个，造成大鼠失血较多，引起高于百草枯LD50的病死率。百草枯大量口服误入可于24 h内迅速出现肺水肿和肺出血，严重者可由此致死，百草枯中毒后全身中毒征象波及多器官系统，大多呈渐进式发展，约1～3 d内肺、肾、肝、心脏及肾上腺等器官发生坏死，后续再进展而亡[13-14]。本研究采集组织样本最长至72 h，渐进式发展至死亡72 h内还未有发生，72 h内未死亡并不能说明病死率较低，针对百草枯病死率的研究需要更长的观察时间(28 d)。

百草枯在大鼠胃中浓度最高的，达峰较快，与临床早期症状一致(恶心、呕吐、腹痛、腹泻及血便等)，百草枯临床中毒后第一时间催吐可能能有效降低体内吸收总量，利于愈后和生存率，同时，及时清理口腔毒物，补液利尿，促进毒物排泄。肺是百草枯损伤的主要靶器官，百草枯入肺较快、排出缓慢，大鼠72 h时肺组织中质量浓度比其他组织均高，百草枯中毒患者的死因大多数为肺部不可逆的纤维化损伤和呼吸窘迫综合征。大脑和小脑由于浓度较低、排出体外较慢等原因，不同时间点浓度差异无统计学意义(P>0.05)，百草枯中毒患者在中毒至死亡的时间内，神志保持清醒，身体外观无明显的不适，这也是百草枯成为让人闻之色变的毒物原因之一。百草枯在各组织中有蓄积、排出缓慢，血浆质量浓度仅能间接反映百草枯体内情况，并不能代表受损伤器官毒物水平，临床上应对症和支持治疗，特别应注意处理好呼吸窘迫综合征、肝坏死和急性肾衰竭等威胁生命的毒效应。通过血液灌流可以祛除血液中的毒物成分，从而减轻或解除毒物对器官的损害。百草枯体内呈现极大的组织间浓度差异和个体差异，应针对每个病例，个性化精准诊断和救治。