血清microRNA-1、LASP1、TAGLN2及LGALS3BP在食管癌诊断中的价值

白云鹏 刘洋 范晓溪

作者单位：110001 沈阳 中国医科大学附属第一医院胸外科

2018年，食管癌新发病例57万余例，死亡病例超50万例，发病率和死亡率在所有癌症中分别排第七位和第六位［1］。食管癌发病隐匿，预后较差，发现时已处于晚期或已发生了区域性、远端转移［2］。因此寻找食管癌早期诊断的生物标志物十分必要。多项研究表明，microRNA-1、肌动蛋白骨架蛋白 1（LASP1）、肌动蛋白结合蛋白2（TAGLN2）和半乳糖凝集素-3结合蛋白（LGALS3BP）均与多种恶性肿瘤的增殖、侵袭和发展有关［3-6］。此外，在膀胱癌和食管癌细胞中LASP1和TAGLN2表达水平与microRNA-1表达水平呈负相关［7-8］，在宫颈癌细胞中LGALS3BP表达水平与microRNA-1表达水平呈负相关［9］，一项关于食管癌患者的临床研究，发现食管癌患者血清中LGALS3BP表达水平升高［10］。因此，本研究检测食管癌患者以及健康对照者血清中microRNA-1和LASP1、TAGLN2及LGALS3BP的表达水平，并分析其在食管癌中的诊断价值，旨在为食管癌的早期诊断提供理论参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2012年1月至2016年1月在沈阳某三甲医院收治的128例食管癌患者作为观察组。所有患者均经病理确诊为食管鳞状细胞癌，在搜集血液样本前未进行任何方式的治疗（如手术、放疗和化疗），排除合并其他部位肿瘤的患者。其中男性73例，女性55例；年龄（62.3±14.5）岁；肿瘤 TNM 临床分期（2009年，第七版）：Ⅰ期33例，Ⅱ期34例，Ⅲ期29例，Ⅳ期32例。选择同期在该院体检的134名健康者作为对照组，其中男性69例，女性65例；年龄（63.6±12.3）岁。性别、年龄、体重、吸烟史、饮酒史及食管癌家族史等在两组间差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究通过医院伦理委员会审批（审批号：2012-32-2），所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

LASP1、TAGLN2和LGALS3BP酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒分别购自美国GenWay公司、LifeSpanBioSciences公司和Abcam公司；microRNA-1以及内参基因U6引物、microRNA提取试剂盒、microRNA第一链cDNA合成（加尾法）试剂盒和microRNA荧光定量PCR试剂盒购自生物工程（上海）股份有限公司；全波长酶标仪购自美国BioTek公司；7500 Real-time PCR仪购自美国ABI公司。

表1 两组人群一般资料比较Tab.1 Comparison of general personal data between two groups

1.3 血清样本采集

所有研究对象于清晨空腹采集静脉血5 mL，室温静置15～20 min，1 500 r/min 离心 15 min，吸取上层淡黄色血清并分装成两管，-80℃保存，分别用于测定血清中 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 及 microRNA-1的表达水平。

1.4 ELISA实验检测血清中 LASP1、TAGLN2和LGALS3BP蛋白的表达水平

采用抗人LASP1、TAGLN2和LGALS3BP单抗分别包被酶标板，将标准品和样品中的LASP1、TAGLN2和LGALS3BP与单抗结合，加入生物素化的抗人LASP1、TAGLN2和LGALS3BP抗体形成免疫复合物连接，与板上辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素与生物素结合。加入酶底物工作液，出现蓝色后加入终止液。最后采用BioTek Epoch全波长酶标仪测定光密度值，通过绘制标准曲线求出样品中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的浓度。

1.5 PCR实验检测血清中microRNA-1 mRNA的表达水平

取100 μL血清，应用microRNA提取试剂盒提取血清中microRNA，参照miRNA第一链cDNA合成（加尾法）试剂盒说明书进行操作，总反应体系为20 μL，包括 2 × miRNA RT Solution mix 10 μL、miRNA RT Enzyme mix 2 μL、microRNA 100 ng，补充 RNase-free water至20 μL。逆转录反应条件为37℃60 min，85℃5 min，转录后cDNA产物于-20℃保存备用。

应用microRNA荧光定量PCR试剂盒以逆转录的cDNA为模板，在7500 Real-time PCR仪上进行荧光定量PCR实验检测血清中microRNA-1的表达。microRNA-1序列：上游引物为5′-CTCGACAAACGTCTAAATGCT-3′，下游引物为 5′-CAGTGGAGCTGGAATGTAAAGAA-3′；内参基因 U6 序列：上游引物为 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物为 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反应总体积为20 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，2×miRNA qPCR master mix 10 μL，上下游引物分别为 0.5 μL，RNase-free water 7 μL。反应条件：预变性95℃ 30 s；变性95℃5 s；退火/延伸60℃ 30 s，共40个循环。反应结束后采用2-△△Ct法计算microRNA-1的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件建立数据库，并进行数据分析。计量资料以均数±标准差（χ±s）来表示，两组间比较采用独立样本的t检验；计数资料以构成比表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析分别检测LASP1、TAGLN2、LGALS3BP与microRNA-1相关性。采用ROC曲线分析microRNA-1、LASP1、TAGLN2及LGALS3B对食管癌的诊断价值，采用Logistic回归结合ROC曲线分析上述4个指标的联合诊断价值，通过ROC曲线下面积（AUC）评价不同指标的诊断效能。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP及microRNA-1表达水平比较

食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的蛋白表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）；但microRNA-1 mRNA表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表2。

2.2 食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP与microRNA-1的相关性

食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP与microRNA-1的表达水平均呈负相关，相关系数依次为-0.713（95%CI：-0.789～-0.616）、-0.667（95%CI：-0.753～-0.558）和-0.722（95%CI：-0.796～-0.627）。见图1。

表2 血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1表达水平比较（χ±s）Tab.2 Comparison of the Expression levels of LASP1，TAGLN2，LGALS3BP and microRNA-1 in serum（χ±s）

图1 食管癌患者血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP与microRNA-1表达的相关性Fig.1 The correlation between LASP1，TAGLN2，LGALS3BP and microRNA-1 in serum of esophageal cancer patients

2.3 microRNA-1、LASP1、TAGLN2及 LGALS3B 表达水平对食管癌的诊断价值

microRNA-1、LASP1、TAGLN2 和 LGALS3BP 的AUC 分别为 0.940（95%CI：0.913～0.967）、0.890（95%CI：0.843～0.936）、0.841（95%CI：0.794～0.889）和 0.924（95%CI：0.893～0.956）。为了进一步提高对食管癌诊断的准确性，本研究综合上述4个指标对食管癌进行联合诊断，联合诊断的 AUC 为 0.970（95%CI：0.954～0.987），均高于单个指标的AUC（P＜0.05）。见表3和图2。

表3microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表达水平单独以及联合诊断食管癌ROC曲线分析Tab.3 ROC curve analysis of microRNA-1，LASP1，TAGLN2，LGALS3BP expression alone and combined diagnosis of esophageal cancer

图 2microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 单独及联合诊断食管癌的ROC曲线Fig.2ROC curve of microRNA-1，LASP1，TAGLN2，LGALS3BP alone and combined diagnosis of esophageal cancer

3 讨论

目前食管癌的诊断主要依靠内镜活检，但价格相对较高，且可能对患者造成一定的创伤。近年来，针对血清中肿瘤相关标志物的检测和研究成为食管癌早期诊断的一种新的途径［9-10］。本研究发现观察组血清中LASP1、TAGLN2和LGALS3BP的蛋白表达水平高于对照组，microRNA-1mRNA表达水平低于对照组，且LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表达水平与microRNA-1表达水平均呈负相关。提示microRNA-1、LASP1、TAGLN2、LGALS3BP表达水平可能对食管癌的诊断有一定的价值。

microRNA是由长度为20～22个碱基组成的非编码小分子RNA，在肿瘤增殖、迁移和凋亡等均有重要的生物学作用［11］。microRNA可作为生物标志物对多种疾病（尤其是肿瘤）具有诊断价值，目前血液中有超过100种不同的microRNA被发现，且可用于多种类型肿瘤诊断［11］。文献报道，microRNA-1与食管癌的发展和预后相关，在食管癌中microRNA-1表达下调，发挥抑癌基因的作用［8］。本研究发现，在食管癌患者血清中microRNA-1表达显著下调，与上述文献报道的结果一致。同时ROC曲线分析显示microRNA-1对食管癌的AUC为0.940，灵敏度和特异度分别为92.19%、84.33%，说明microRNA-1在食管癌的诊断中灵敏度较好，但是特异度稍差。

LASP1是一类肌动蛋白结合蛋白，与乳腺癌的发展和转移有关［12］，且其在卵巢癌、肝癌中表达上调［13-14］。本研究发现，食管癌患者血清中 LASP1水平高于对照组，应用ROC曲线分析LASP1对食管癌的诊断价值，结果显示AUC为0.890，灵敏度和特异度分别为81.25%、99.25%，说明LASP1对食管癌的诊断中灵敏度较差，但是有很高的特异度。

TAGLN2是钙结合蛋白家族成员，主要参与细胞分化、黏附和迁移，TAGLN2在膀胱癌表达异常［7］。本研究中食管癌患者血清中TAGLN2水平明显升高。ROC曲线分析显示，AUC为0.841，灵敏度和特异度分别为88.28%、70.15%，提示TAGLN2作为食管癌诊断的标志物具有一定的应用价值，但其特异度并不高。

LGALS3BP是一类分子量约为90 kDa的糖蛋白，与巨噬细胞凝集素、Mac 2和富含半胱氨酸的巨噬细胞受体结构域成员有关，LGALS3BP可上调肿瘤细胞中黏附分子的表达［15］，其在肺癌和前列腺癌中表达上调［16-17］。最近的一项研究发现，LGALS3BP在食管癌患者血清中表达水平显著升高［9］，本研究亦显示其在食管癌患者血清中表达升高。ROC曲线分析显示，AUC为0.924，灵敏度和特异度分别为80.47%、100%，说明LGALS3BP作为食管癌诊断的血清学标志物，其特异度很高，但是灵敏度上稍弱。

在应用上述指标对食管癌单独诊断的基础上，本研究进一步分析了上述指标联合诊断食管癌的价值，结果发现联合诊断的AUC明显高于各个指标的单独诊断，联合诊断的灵敏度和特异度均达到了90%以上，说明在食管癌的诊断中，多指标联合的诊断价值要优于单独指标诊断。

综上所述，本研究发现血清LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1对食管癌具有一定的诊断价值，此外血清 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP和microRNA-1联合诊断食管癌的诊断价值要高于单独指标诊断，且 LASP1、TAGLN2、LGALS3BP 与microRNA-1表达水平呈负相关，但microRNA-1是否可以负向调节血清中LASP1、TAGLN2、LGALS3BP水平仍需进一步的研究证实。