骨髓激酶X对宫颈癌细胞增殖的影响及可能的作用机制

李晓兰 赵骏达 马俊旗

作者单位：830054 乌鲁木齐 新疆医科大学第一附属医院妇科中心

宫颈癌是全球女性癌症死亡的第四大原因［1］。有研究报道，一些癌基因和转录因子可能参与宫颈癌的发生和发展［2-3］。骨髓激酶X（bone marrow X-linked kinase，BMX）是Tec家族细胞内非受体酪氨酸激酶成员［4-7］。BMX可介导前列腺癌和膀胱癌等细胞增殖、存活、迁移、侵袭和凋亡［8-9］。PI3K/Akt/mTOR信号通路对肿瘤发生、细胞周期进展、细胞迁移、增殖和存活有重要作用［10］。研究［10-12］表明，PI3K/Akt/mTOR通路在结直肠癌、卵巢癌及乳腺癌等肿瘤中异常激活。本研究探讨BMX在人宫颈癌增殖的影响及其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

人宫颈癌细胞系HeLa（HeLa-野生型细胞）购自美国ATCC公司，10%胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM培养基、MTT购自美国Sigma Aldrich 公司，BMX、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin及二级抗体均购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶购自美国Thermo Fisher Scientifc公司，Trizol、逆转录试剂盒购自日本Takara公司，Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司，BMX-IN-1、LFM-A13购自美国MCE公司，MK-2206和雷帕霉素购自美国Selleck公司，APC-BrdU细胞增殖检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，Olympus-Cx31显微镜购自日本Olympus公司，FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司。

1.2 细胞系和组织样本

将HeLa细胞接种在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养。收集2013—2017年本院34例正常子宫颈组织、25例原位宫颈癌组织和52例浸润性宫颈癌组织标本。所有患者均未接受化疗、免疫治疗或放射治疗。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者在采集标本前均签署知情同意书。

1.3 免疫组织化学法检测BMX的表达

选取正常宫颈、原位宫颈癌及浸润性宫颈癌组织并用10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，制片。免疫组化染色采用En Vision两步法，所用抗体包括BMX抗体及二级抗体，具体操作步骤参照试剂盒说明及全自动免疫组化标准操作流程。BMX染色结果采用IRS表示，IRS为每个样本中的染色强度值（0分：无染色；1分：弱染色；2分：中度染色；3分：强染色）和阳性细胞百分比值（0分：＜10%；1分：10%～25%；2分：26～50%；3分：51～75%；4 分：76～100%）的乘积，IRS＞3为阳性，IRS≤3为阴性。

1.4 载体构建和细胞转染

采用TALEN敲除技术成功构建BMX-TALEN重组质粒载体。按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书转染BMX-TALEN重组质粒，BMX-TALEN重组质粒与LipofectamineTM 2000的配制比例为1∶3，将其加入9孔板中构建低表达BMX的HeLa-BMX+/-细胞。以含有10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养的野生型HeLa细胞为对照。转染48 h后，采用Western blot检测BMX蛋白的表达水平以鉴定转染效率。

1.5 Western blot检测蛋白表达水平

将随机选择的7例原位宫颈癌组织与7例正常宫颈组织，HeLa-野生型细胞和转染后的HeLa-BMX+/-细胞，DMSO、Akt抑制剂(MK-2206)和 mTOR抑制剂雷帕霉素分别处理的HeLa-野生型和BMX+/-细胞，分别放入含有新加入的蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中，冰上裂解30～45 min。BCA法测定蛋白浓度，将蛋白质加入5×上样缓冲液中，95℃ 煮沸10 min。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质，印迹至活化的聚偏二氟乙烯膜。室温封闭1 h，分别加入BMX抗体（稀释比例为 1∶2 000）、Akt抗体（稀释比例为1∶500）、p-Akt抗体（稀释比例为 1∶1 000）、mTOR 抗体（稀释比例为 1∶1 000）、p-mTOR 抗体（稀释比例为1∶1 000）及 β-actin 抗体（稀释比例为 1∶1 000），4 ℃温育过夜。将印迹与偶联于辣根过氧化物酶的第二抗体室温孵育1 h，在X光片上采用ECL法显影，用成像分析系统分析目的蛋白及内参β-actin灰度值的比值，作为目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.6 MTT检测细胞的生长速度及细胞活力

采用DMEM培养基调整各组细胞悬液浓度为2×103·mL-1，接种于 96 孔板，每孔体积 200 μL，每组3个复孔。分别于第1天、第3天、第5天和第7天用血细胞计数器计数，绘制细胞生长曲线。

1.7 流式细胞仪分析细胞周期变化

将BMX-IN-1处理后的HeLa细胞、DMSO处理后的HeLa细胞、HeLa-野生型细胞及转染后HeLa-BMX+/-细胞接种在60 mm培养皿中24～48 h，并用30 μm BrdU标记30～60 min。待生长至50%～70%融合时收取细胞，置于4℃下的70%冷乙醇固定过夜。PBS洗涤2次，采用APC-BrdU细胞增殖检测试剂盒对细胞进行抗APC-BrdU染色后，用FACS Calibur流式细胞仪分析，Flowjo 7.6软件分析细胞周期的分布。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据分析。计量数据采用均数±标准差（χ±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMX在正常宫颈及宫颈癌组织中的表达

免疫组织化学法检测结果显示，正常宫颈组织BMX阳性表达率为26.5%（9/34），原位宫颈癌组织BMX阳性表达率为68.0%（17/25），浸润性宫颈癌组织BMX阳性率为88.5%（46/52），组间比较差异有统计学意义（χ2=34.804，P＜0.001），两两比较差异均有统计学（P＜0.05），见图 1。Western blot结果显示，7例原位宫颈癌组织中BMX的表达明显高于7例正常宫颈组织（P＜0.05），见图 2。

2.2 转染结果

Western blot检测结果显示，HeLa-野生型细胞中BMX蛋白的表达高于HeLa-BMX+/-细胞（t=9.527，P＜0.001），说明本研究成功构建低表达 BMX的HeLa-BMX+/-细胞，见图 3。

图1 BMX在不同宫颈组织中的表达（×100）Fig.1 Expression of BMX in different cervical tissues（×100）

图2 Western blot法检测宫颈癌和正常宫颈组织中BMX的表达Fig.2 Western blot analysis of BMX expression in cervical cancer

图3 Western blot检测BMX蛋白的表达Fig.3 The expression of BMX detected by Western blot

2.3 BMX对宫颈癌细胞生长速度及细胞周期的影响

MTT法检测结果显示，HeLa-BMX+/-细胞的生长速度较HeLa-野生型细胞慢，见图4。流式细胞术检测结果显示，与HeLa-DMSO细胞比较，HeLa-BMX-IN-1细胞中 G0/G1 期细胞比例较高［（50.4±5.7）%vs（42.5±4.3）%，t=7.234，P＜0.001］，而 G2/M 期细胞比例较低［（22.9±2.9）%vs（29.1±3.1）%，t=5.491，P＜0.001］；与HeLa-野生型细胞比较，HeLa-BMX+/-细胞中G0/G1期细胞比例亦较高［（52.1±6.5）%vs45.9±5.7）%，t=5.715，P＜0.001］，而 G2/M 期细胞比例较低［（19.5±1.4）%vs（25.4±3.6）%，t=5.873，P＜0.05］，见图5。

图4 HeLa-BMX+/-细胞和HeLa-野生型细胞的细胞生长曲线Fig.4 The growths curve of HeLa-BMX+/-cells and HeLa-wild type cells

图5 BMX对宫颈癌细胞周期的影响Fig.5 The effect of BMX on cell cycle of cervical cancer cells

2.4 BMX通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进宫颈癌细胞活力

Western blot结果显示，BMX和p-Akt在HeLa-BMX+/-细胞中的表达低于HeLa-野生型细胞，差异均有统计学意义（t=6.282，8.117，均P＜0.001）；两种细胞的总Akt表达水平差异无统计学意义（t=2.035，P=0.126），见图6A。DMSO处理后HeLa-BMX+/-细胞中p-Akt和p-mTOR的表达低于HeLa-野生型细胞；与DMSO处理组比较，MK-2206处理和雷帕霉素处理后HeLa-野生型和BMX+/-细胞中p-Akt和p-mTOR的表达均受抑制，见图6B。MTT检测结果显示，DMSO处理后，HeLa-BMX+/-细胞生长速度较HeLa-野生型细胞慢；MK-2206和雷帕霉素处理后，HeLa-野生型和HeLa-BMX+/-细胞生长均较DMSO处理的细胞慢，见图6C。

图6BMX对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响Fig.6 Effect of BMX on the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

3 讨论

TEC激酶家族是第二大非受体蛋白酪氨酸激酶家族，BMX是该家族的成员之一。研究报道BMX可能参与造血细胞、心内膜、动脉内皮以及其他细胞的免疫反应、炎症和细胞因子信号传导［13］。此外，BMX在肾癌、膀胱癌等肿瘤中表达，参与细胞生长、转化、迁移、存活、凋亡［8-9］。本研究用免疫组织化学法检测正常宫颈、原位宫颈癌和浸润性宫颈癌组织样本中BMX的表达。结果显示，BMX在宫颈癌组织中的表达高于正常子宫颈组织，随机选择正常子宫颈组织和宫颈癌组织各7例，然后采用Western blot法检测BMX的表达，亦发现BMX在宫颈癌组织中高表达，提示BMX可能参与宫颈癌的发生发展。为此，本研究构建重组BMX-TALEN质粒并转染HeLa细胞，成功构建低表达BMX的HeLa-BMX+/-细胞，然后采用Western blot检测，结果发现HeLa-野生型细胞中BMX的表达明显高于HeLa-BMX+/-细胞，而 HeLa-BMX+/-细胞生长较HeLa-野生型细胞慢，且BMX-IN-1处理的HeLa细胞G0/G1期细胞比例明显增加，而G2/M期细胞比例明显降低，说明敲低BMX表达后，细胞被阻滞在G0/G1期，从而抑制了肿瘤细胞增殖，减弱细胞增殖和活力。

目前，研究已证实的宫颈癌发展机制主要与PI3K/Akt/mTOR、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）细胞外信号相关激酶（ERK1/2）、Janus激酶 2（JAK2）/信号转导和转录激活因子-3（STAT3）、JAK3/STAT5、NF-κB、Wnt/β-catenin 和 c-Jun N-末端激酶（JNK）/p-38 等信号通路有关［14-15］。尤其PI3K/Akt/mTOR信号通路与肿瘤细胞增殖和存活密切相关［10］，其活性异常可导致细胞恶性转化，促进肿瘤细胞迁移、黏附、肿瘤血管生成和细胞外基质降解［16］。GUO等［9］研究发现膀胱癌细胞中BMX过度表达可提高Akt的活性，而敲除BMX则抑制Akt的活性。本研究Western blot结果显示，HeLa-BMX+/-细胞中BMX和p-Akt表达较HeLa-野生型细胞降低，两种细胞的Akt表达水平相当，说明敲除BMX可以降低HeLa-BMX+/-细胞中p-Akt/Akt的表达，BMX能增强p-Akt/Akt的活性。进一步采用MK-2206和雷帕霉素作用HeLa-野生型和HeLa-BMX+/-细胞后，发现p-AKT和p-mTOR表达受抑制，且细胞生长变缓，提示BMX可能激活Akt的磷酸化，而mTOR作为一个典型的下游因子亦受到影响，BMX可能通过PI3K/Akt/mTOR途径促进宫颈癌细胞增殖和肿瘤形成，但BMX如何调节这一通路仍有待进一步研究。