lncRNA MEG3和lncRNA GAS5在多发性骨髓瘤血清中的表达及其临床意义

高鹏 肖中平 付堃 封韬 杨丹 韩梅

作者单位：130021 长春 吉林省人民医院血液科

多发性骨髓瘤是一种以贫血、感染、骨痛、肾功能障碍等非特异性临床表现为症状的常见血液系统恶性肿瘤［1］。多发性骨髓瘤前期症状不典型，且对常规治疗方案反应差，生存期短。母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是存在于人类染色体14q32.3上的长链非编码RNA（longnon-coding RNA，lncRNA），可抑制肿瘤发生，在人体正常组织中高表达，而在肿瘤组织中低表达或表达缺失［2-4］。生长特异抑制物5（growth arrest-specific transcript 5，GAS5）是位于人类染色体1q25.1上的lncRNA，其在生长受抑制的细胞中低表达，而在成熟组织中高表达，可能作为抑癌基因发挥作用［5-6］。但目前两者与多发性骨髓瘤的关系鲜见报道。本研究检测lncRNA MEG3和lncRNA GAS5在多发性骨髓瘤患者血清中的表达，并分析其与患者临床病理特征的关系，探讨其在预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年1月至2016年1月吉林省人民医院收治的87例多发性骨髓瘤患者为研究对象。纳入标准：⑴符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南（2013年修订）》诊断标准［7］；⑵预计生存期＞3 个月；⑶未行抗多发性骨髓瘤治疗。排除标准：⑴合并其他恶性肿瘤者；⑵合并自身免疫系统疾病者；⑶合并感染性疾病、重要器官性质病变者。87例患者中男性46例，女性41例，年龄 30～68 岁，平均年龄（49.5±6.7）岁；按Durie-Salmon分期（D-S分期）：Ⅰ期25例，Ⅱ期28例，Ⅲ期34例。同时选取于本院进行健康体检的54名志愿者为对照组，其中男性27例，女27性例，年龄28～69 岁，平均年龄（48.7±5.8）岁。两组研究对象年龄、性别等差异无统计学意义（t=0.725，P=0.470；χ2=0.110，P=0.740）。本研究经吉林省人民医院伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂与仪器

cDNA合成试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自BIOMIGA公司，Light Cycler96荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏公司。

1.3 qRT-PCR检测lncRNA MEG3和lncRNA GAS5 mRNA的表达

抽取两组患者清晨空腹外周血液，提取血清后置于-80℃冰箱中保存备用并提取血清总RNA，取5 μL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性。按照BIOMIGA公司逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以18s为内参，引物序列见表1。取cDNA进行qRT-PCR。定量PCR条件：95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，共40个循环，每个样品设置3个复孔。qRTPCR 反应体系：cDNA 产物 2 μL，50×ROX reference dye 0.4 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物各 0.8 μL，加去RNase水补足至20 μL。读取目的lncRNA及内参的循环阈值（Ct值），以2-△△Ct表示样品中目的基因的相对表达量。

表1qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 随访

采取门诊复诊、电话随访、电子邮件随访及信件随访等方式进行随访，每月随访1次，自患者入院随访至2019年1月31日。随访中位时间为28个月，以患者死亡、失访或最后随访时间为终点，统计存活、死亡、失访人数。总生存期（overall survival，OS）定义为自患者入组开始至因任何原因死亡的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计数资料采用［n（%）］表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用均数±标准差（χ±s）描述，组间比较采用独立样本t检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank法；采用Cox回归模型分析lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表达水平与多发性骨髓瘤患者OS的关系，计算风险比（HR）及其对应的95%可信区间（CI）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5在多发性骨髓瘤患者血清中的表达

多发性骨髓瘤患者血清中lncRNA MEG3和lncRNA GAS5的表达水平均低于对照组（5.92±0.87vs9.13±1.26，t=17.882，P＜0.001；4.27±0.51vs8.26±1.04，t=30.417，P＜0.001），见图 1。

2.2 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5的表达水平与多发性骨髓瘤患者临床病理特征的关系

根据lncRNA MEG3平均表达水平（5.92）将患者分为MEG3低表达组（n=43）和MEG3高表达组（n=44），再根据lncRNA GAS5平均表达水平（4.27）将患者分为GAS5低表达组（n=37）和GAS5高表达组（n=50）。结果显示，lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表达水平与患者性别和血清钙含量无关（P＞0.05），与年龄、D-S分期、恶性浆细胞数量、β2-MG水平、血红蛋白含量有关（P＜0.05），见表 2。

图1lncRNA MEG3、lncRNA GAS5在多发性骨髓瘤患者和健康志愿者血清中的表达Fig.1 Expression of lncRNA MEG3 and lncRNA GAS5 in serum of patients with multiple myeloma and healthy subjects

表2 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表达水平与多发性骨髓瘤患者临床病理特征的关系［n（%）］Tab.2 The relationships between levels of serum lncRNA MEG3 and lncRNA GAS5 and clinical data of patients with multiple myeloma［n（%）］

2.3 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表达水平与多发性骨髓瘤患者生存的关系

本组所有患者均完成随访，无失访病例，死亡48例，总生存率为47.83%。其中MEG3低表达组中位OS为 18 个月（95%CI：13.48～25.37），3 年总生存率为32.56%；MEG3高表达组中位OS为29个月（95%CI：21.38～34.27），3年总生存率为56.82%；两组比较差异有统计学意义（χ2=5.617，P=0.018），见图2A。GAS5低表达组中位 OS 为 17 个月（95%CI：12.91～26.14），3年总生存率为32.43%；GAS5高表达组中位OS为30个月（95%CI：22.61～35.51），3年总生存率为 52.00%，两组比较差异有统计学意义（χ2=5.389，P=0.020），见图2B。

2.4 lncRNA MEG3和lncRNA GAS5表达水平与多发性骨髓瘤患者预后的关系

单因素Cox回归分析显示，年龄、D-S分期、恶性浆细胞数量、β2-MG水平、血红蛋白含量、lncRNA MEG3表达水平和lncRNA GAS5表达水平与多发性骨髓瘤患者预后有关。多因素Cox回归分析显示，lncRNA MEG3低表达、lncRNA GAS5低表达和恶性浆细胞数量＞30%与多发性骨髓瘤患者不良预后有关（HR=3.503，95%CI：1.517～8.091；HR=3.319，95%CI：1.438～7.661；HR=3.333，95%CI：1.651～6.729），见表 3。

图2lncRNA MEG3及lncRNA GAS5表达水平与多发性骨髓瘤患者生存的关系Fig.2 Relationship between expression levels of lncRNA MEG3 and lncRNA GAS5 and survival of patients with multiple myeloma

表3 影响多发性骨髓瘤患者预后的单因素及多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of prognosis in patients with multiple myeloma

3 讨论

多发性骨髓瘤源于免疫系统淋巴细胞，是血液系统常见的恶性肿瘤之一，预后较差［8-9］。目前临床上评估多发性骨髓瘤预后的指标预测效果不佳，因此寻找新的预后判断指标具有重要意义。lncRNA是一类与肿瘤发生发展及预后密切相关的RNA总称，是肿瘤诊断及预后评估的潜在分子标志物。每种lncRNA都具有一定的结构和生化特性，根据其自身特性，可分为促肿瘤lncRNA和抑肿瘤lncRNA［10-11］。目前认为lncRNA在血清中表达稳定，且重复性高，有望成为新型肿瘤诊断标志物［12］。

MEG3是第一个被发现的具有肿瘤抑制作用的lncRNA，由10个外显子构成［13］。研究显示，lncRNA MEG3在人体正常组织中恒定表达，而在肿瘤患者组织中表达下降甚至缺失［14］。MEG3可通过多种途径发挥抑癌作用，如在胰腺癌中通过活化p53介导的lncRNA MEG3可抑制胰腺癌细胞增殖，在肺癌中Rb信号通路基因甲基化可降低lncRNA MEG3表达水平，从而促进肺癌细胞增殖［15-16］。此外，有研究表明，lncRNA MEG3可能通过Notch、DNA甲基化等多种信号通路参与肿瘤发生发展［17-18］。GAS5包含多个外显子和内含子，外显子序列转录出lncRNA，内含子则编码多个 ncRNA。PICKARD 等［19］研究表明，lncRNA GAS5可影响糖皮质激素及其受体，从而负调控淋巴细胞存活，抑制下游基因表达，在乳腺癌患者体内呈低表达。LIU等［20］报道lncRNA GAS5在膀胱癌组织中的表达水平低于正常组织。另有学者研究发现lncRNA GAS5在淋巴瘤中过表达，且可增强抗肿瘤药物的细胞毒效应从而抑制肿瘤细胞增殖［21］。本研究发现多发性骨髓瘤患者血清中lncRNA MEG3和lncRNA GAS5的表达水平均低于健康对照者，提示两者可能参与多发性骨髓瘤的发生发展。进一步分析显示，lncRNA MEG3、lncRNA GAS5的表达水平与患者年龄、D-S分期、恶性浆细胞数量、β2-MG水平和血红蛋白含量有关，亦证明两者均可能参与多发性骨髓瘤的发生发展。生存分析结果显示，MEG3低表达组3年的生存率低于MEG3高表达组，GAS5低表达组3年的生存率亦低于GAS5高表达组，提示lncRNA MEG3、lncRNA GAS5低表达可能与多发性骨髓瘤患者不良预后有关。Cox回归分析显示，lncRNA MEG3低表达、lncRNA GAS5低表达和恶性浆细胞数量＞30%是影响多发性骨髓瘤患者预后的独立危险因素，lncRNA MEG3和lncRNA GAS5有望成为预测多发性骨髓瘤患者预后的指标。

综上所述，lncRNA MEG3和lncRNA GAS5在多发性骨髓瘤患者血清中低表达，且与患者年龄、D-S分期、恶性浆细胞数量、β2-MG水平和血红蛋白含量有关，是影响患者不良预后的独立危险因素，因此检测lncRNA MEG3和lncRNA GAS5水平有望预测多发性骨髓瘤的预后。但本研究样本量较少、随访时间较短，因此仍需大样本及进一步随访探究其作用机制。