miR-125b-5p对喉鳞状细胞癌细胞能量代谢及增殖的影响

陈永果 邢军

作者单位：274400 菏泽 1曹县人民医院耳鼻喉科；250117 济南 2山东省肿瘤医院放疗科

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉癌最常见的病理类型，约占头颈部细胞癌的25%［1］。手术切除是早期LSCC最有效的治疗方式，目前缺乏早期诊断的生物标志物，易误诊为晚期癌症转移，5 年生存率不理想［2-3］。微小 RNA（miRNA）是内源性单链非编码RNA，广泛参与细胞增殖、分化、迁移、转化和凋亡［4-6］。如miR-503通过靶向程序性细胞死亡蛋白4促进LSCC的发生［7］；miR-26b通过靶向ATF2抑制喉癌的顺铂耐药。miRNAs可能是LSCC发生和治疗的新靶点［8］。糖酵解过程需要表达几种负责将葡萄糖转化为乳酸的酶，己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是其一［9-11］。miR-125b-5p 在HK2的3'-UTR处存在结合位点［12］，HK2可能在糖酵解中发挥关键功能，在癌细胞能量代谢中发挥重要作用。本研究通过检测miR-125b-5p在LSCC细胞中的表达和功能，并分析HK2的调节作用，旨在探讨miR-125b-5p对LSCC能量代谢和增殖的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

LSCC细胞系和人正常支气管上皮细胞系购自美国 Sciencell公司；RNA逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-125b-5p模拟物和模拟对照miRNA（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）购自中国锐博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；miRNeasy Mini试剂盒购自美国Qiagen公司；One Step PrimeScript miRNA cDNA合成试剂盒购自中国Takara公司；抗HK2抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；葡萄糖摄取比色测定试剂盒和乳酸盐比色测定试剂盒购自美国Milpitas公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 LSCC细胞和人正常支气管上皮细胞置于Dulbecco改良的含10%胎牛血清Eagle培养基，于37℃、5%CO2中培养。实验分为miR-125b-5p转染组（miR-125b-5p模拟物转染LSCC）和对照组（空质粒转染LSCC细胞）。取对数生长期的LSCC细胞置于6孔板中培养。孵育过夜后，将miR-125b-5p模拟物和模拟对照miRNA经Lipofectamine 2000根据制造商的说明将miRNA转染到LSCC细胞中。转染12 h后，用含10%FBS的新鲜DMEM替换培养基培养7 d，细胞转染培养环境为100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、含5%CO2的37°C湿润环境。

1.2.2 RT-qPCR检测LSCC细胞miR-125b-5p的表达水平 采用miRNeasy Mini试剂盒从LSCC细胞系中提取miRNA。使用NanoDrop-2000分光光度计测量RNA的浓度，将miRNA逆转录成cDNA，使用ABI7500实时PCR系统进行RT-qPCR。PCR扩增反应体系：2×Taq Master Mix 10 μL，Primer set 1 μL，probe 0.4 μL，cDNA 8.6 μL。PCR 扩增条件为：95.0 ℃3 min，95.0 ℃ 12 s，62.0 ℃ 40 s，95.0 ℃ 12 s，循环40次。以β-actin为内参对照。采用2-ΔΔCt法分析miR-125b-5p的相对表达水平。miR-125b-5p的RT-qPCR引物序列：Forward primer（5'-3'）为TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA；Reverse primer（5'-3'）为 AGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC。β-actin的RT-qPCR引物序列：Forward primer（5'-3'）为 TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC；Reverse primer（5'-3'）为 CCAGTGCAGGGTCCGAGGT。

1.2.3 CCK-8实验检测LSCC细胞的增殖能力 将miR-125b-5p转染组和对照组细胞接种于96孔板中，每孔 1 000 个细胞。分别在 0 h、24 h、48 h、72 h 和96 h时间点用CCK-8测定LSCC细胞的活力。向培养基中加入10 μL CCK-8试剂，并在37℃下再孵育2 h。用酶标仪检测450 nm处每孔的吸光度（OD）。实验重复3次取平均值。细胞增殖率的计算公式：细胞活力=［（OD加药-OD空白）/（OD加药0-OD空白）］×100%。其中，OD加药为具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度；OD空白为具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度；OD加药0为具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度；细胞活力指细胞增殖活力或细胞毒性活力。

1.2.4 平板集落形成实验检测LSCC细胞集落形成能力 将miR-125b-5p转染组和对照组的LSCC细胞接种在6孔板中，每孔500个细胞。在37℃下培养2周后，在室温下用甲醇固定15 min，0.1%结晶紫染色。采用磷酸盐-盐水（PBS）洗涤2次，并用显微镜计算集落数。集落抑制率=（1-miR-125b-5p转染组落形成数/对照组集落形成数）×100%。

1.2.5 检测miR-125b-5p与HK2的3'-UTR结合情况 采用 TargetScan（www.targetscan.org/vert_71/）预测miR-125b-5p的下游靶基因，在HK2的3'-UTR1370-1377的核苷酸处发现miR-125b-5p结合的靶位点（CCUCAGGGA）。为检测HK2是否是miR-125b-5p的功能靶标，通过在miR-125b-5p转染组或对照组下转染野生型和突变体（3'-UTR mut）并进行荧光素酶报告基因测定。

1.2.6 流式细胞术检测LSCC细胞的凋亡情况 将miR-125b-5p转染组和对照组的细胞转染48 h后，通过离心获取细胞并用预冷PBS洗涤2次。用1×膜联蛋白结合剂将细胞沉淀重悬浮。将5 μL膜联蛋白V和1 μL碘化丙啶加入100 μL细胞悬浮液中，在室温下温育15 min后，将400 μL 1×膜联蛋白结合缓冲液加入细胞悬液中，用流式细胞仪分析LSCC细胞的凋亡情况。实验重复3次取平均值。每个样品随机计数4个视野，按公式计算凋亡指数（AI）。AI=凋亡细胞数/（凋亡细胞数+正常细胞数）。

1.2.7 Western blot检测LSCC细胞HK2蛋白的表达水平 采用NP-40缓冲液裂解细胞，获得miR-125b-5p转染组和对照组LSCC细胞的总细胞裂解物。采用Bradford法测定蛋白质浓度。通过15%SDS PAGE分离每个样品的20 μg蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h后，将膜与抗HK2 抗体（1∶1 000）一起孵育，保持 2 h。然后用 Tris Bu盐水和TBST洗涤膜2次。用LI-COR Odyssey成像系统显现蛋白质条带。目的蛋白表达水平=目标蛋白的分光管密度/Mark蛋白的密度。

1.2.83H-2DG法测定葡萄糖摄取量 根据FISCHER等［12］报道，以细胞对3H-2DG摄取量反映葡萄糖的摄取情况。两组细胞无血清条件下培养24 h后换为低糖DMEM培养液，以1 mol/L异丙肾上腺素、10 mol/L去甲肾上腺素分别刺激细胞48 h，然后加入去甲肾上腺素，在加入药物同时加入37 kBq/mL3H-2DG，继续培养48 h，20 mol/L细胞松弛素终止反应。0.5 mol/L氢氧化钠裂解细胞15 min后，加入同体积0.5 mol/L盐酸中和。用BCA法测定蛋白含量，用液闪仪测定加入闪烁液中细胞裂解液的dpm值。不加任何激动剂只加入20 mol/L细胞松弛素培养48 h测得的dpm值为细胞非特异性结合的放射活性。细胞3H-2DG摄取量=（细胞总放射活性-非特异性结合的放射活性）/蛋白含量。

1.2.9 乳酸盐比色测定试剂盒检测乳酸产量 采用乳酸盐比色测定试剂盒，通过分光光度计检测乳酸盐吸光度，以蒸馏水调零，比色杯光径1.0 cm，读取空白管、对照管、标准管、测定管的340 nm吸光度（OD），2 h内检测完毕。乳酸产量（mmol/g）=［（OD测定-OD对照）/（OD标准-OD空白）］×5/待测样品蛋白浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件（美国IBM公司）进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（χ±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；LSCC细胞系和正常细胞系中的miR-125b-5p表达水平的比较采用配对样本t检验。本研究以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-125b-5p在LSCC细胞系中表达下调

RT-qPCR实验结果显示，与人正常支气管上皮细胞相比，miR-125b-5p在LSCC细胞系中的表达降低（0.68±0.03vs0.22±0.05，t=7.025，P=0.001），见图 1。

图1 miR-125b-5p的表达水平Fig.1 Expression of miR-125b-5p

2.2 miR-125b-5p的过表达抑制LSCC细胞的增殖能力

CCK-8实验结果显示，转染0 h、24 h和48 h后，miR-125b-5p转染组与对照组细胞增殖能力比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；转染72 h和96 h后，miR-125b-5p转染组LSCC细胞的增殖能力低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 转染后不同时间LSCC细胞的增殖能力Tab.1 Proliferative ability of LSCC cells at different time after transfection

2.3 miR-125b-5p过表达诱导LSCC细胞凋亡和降低集落形成能力

流式细胞术实验结果显示，miR-125b-5p转染组LSCC 细胞凋亡率高于对照组［（37.52±2.34）%vs（12.46±3.52）%，t=7.025，P＜0.001）］。miR-125b-5p 转染组LSCC细胞的集落形成能力低于对照组（0.29±0.02vs1.02±0.03，t=5.689，P=0.005）。

2.4 miR-125b-5p与HK2的3'-UTR直接结合

荧光素酶报告基因测定实验结果显示，miR-125b-5p转染组的荧光素酶活性低于对照组（0.32±0.03vs1.01±0.02，t=7.543，P=0.001）。表明 miR-125b-5p与HK2的3'-UTR之间的直接结合。

2.5 miR-125b-5p过表达抑制LSCC细胞HK2蛋白表达

Western blot实验结果显示，miR-125b-5p转染组miR-125b-5p过表达的LSCC细胞中HK2的蛋白表达水平低于对照组（0.12±0.02vs0.75±0.03，t=5.875，P=0.023），见图2。表明miR-125b-5p可负调节LSCC细胞中HK2的表达。

图2LSCC细胞HK2蛋白表达Fig.2 Expression of HK2 protein in LSCC cells

2.6 miR-125b-5p过表达抑制LSCC细胞的糖酵解能力

3H-2DG摄取测定法实验结果显示，miR-125b-5p转染组LSCC细胞葡萄糖消耗低于对照组［（3.85±0.86）dpm/mgvs（10.52±1.34）dpm/mg，t=6.118，P=0.005］。miR-125b-5p转染组LSCC细胞的乳酸产生量亦低于对照组［（4.23±1.36）dpm/mgvs（10.96±2.45）dpm/mg，t=5.907，P=0.002］。

3 讨论

能量代谢通路紊乱与细胞线粒体功能异常有关，而乳酸和丙酮酸异常则可能与糖酵解途径有关［12-14］。糖酵解的一些代谢中间体也为脂类、氨基酸及其他生物合成提供前体和原料。从氧化磷酸化到癌细胞的有氧糖酵解重新编程，这一独特的代谢为探索癌症进展的分子机制提供了新的方向，而参与糖酵解酶的下调可能是抑制肿瘤发生的途径［15］。miRNAs是一类由发卡结构转录物形成的短单链非编码RNA，通过与编码蛋白mRNA的3'-UTR区域进行互补结合，抑制mRNA翻译或直接导致mRNA降解，负向调控基因表达。有研究发现在食管鳞状细胞癌中miR-125b-5p通过靶向高迁移率族蛋白A2，发挥肿瘤抑制作用［16］。在胆囊癌中亦发现miR-125b-5p的肿瘤抑制作用，且miR-125b-5p表达上调被认为是该病早期HBV阳性肝细胞癌的新型生物标志物［17］。miRNA参与调控肿瘤的发生和发展［18］。本研究发现，相较于人正常支气管上皮细胞，LSCC细胞中miR-125b-5p的表达下调，且过表达miR-125b-5p可抑制LSCC细胞活力和细胞集落形成能力，并诱导细胞凋亡，进一步分析发现，过表达miR-125b-5p亦可降低 LSCC细胞葡萄糖消耗和乳酸产生量，说明miR-125b-5p在喉鳞状细胞癌中可抑制有氧糖酵解，可能作为抑癌因子发挥作用。

miRNA在mRNA上的结合位置主要认为在3'-UTR上，但研究表明，miRNA也能结合到5'-UTR甚至CDS 区行使功能［19］。SHIVRAM 等［20］报道，结合到5'-UTR的miRNA常常起到转录激活的作用，这有可能是RISC复合物“撑”开了折叠的mRNA，方便转录起始因子或核糖体进入。因此，miRNA发挥作用是通过调控靶蛋白表达和功能进行。研究者已经在多种癌症中发现了HK2的过度表达，这与癌细胞的葡萄糖代谢增加有关［21］。因此，HK2有可能是miRNA调节癌症中糖酵解过程的靶基因，也即HK2是miR-125b-5p靶蛋白。miR-125b-5p抑制糖酵解、抑制增殖能力、促进凋亡和抑制集落的作用很可能是通过下调HK2而实施。据报道，在肝癌中miR-199a负调节HK2的表达，从而抑制葡萄糖消耗和乳酸产生。此外，miR-98通过靶向HK2抑制结肠癌中的Warburg效应。在本研究中，过表达miR-125b-5p亦抑制了LSCC细胞中HK2蛋白的表达，与上述研究结果一致。

综上所述，本研究发现miR-125b-5p可能通过靶向HK2并负调节HK2表达，从而降低LSCC细胞糖酵解，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，miR-125b-5p有望成为治疗LSCC的潜在治疗靶点。