超高效液相色谱－串联质谱法测定奶粉中地塞米松

2019-10-23李首道涂凤琴陈烨超陈丹卢跃鹏康翠欣何丽姗

食品研究与开发 2019年20期

李首道，涂凤琴，陈烨超，陈丹，卢跃鹏，康翠欣，何丽姗

（武汉食品化妆品检验所，湖北武汉430012）

近年来，奶粉的质量问题越来越受到国家的重视，也在全世界范围内引起了广泛关注。而婴幼儿配方奶粉中激素类药物的残留量也已经成为社会关注的焦点问题。地塞米松作为一种糖皮质激素除了治疗功能外[1-3]，还有着提高饲料的转化率，增加动物体重等功效，其在食品链的残留也受到大家的关注。地塞米松能够降低人体的免疫功能，长期食用含有激素的奶粉易诱发感染并且可通过抑制生长激素的分泌而导致负氮平衡，使儿童的生长发育受到影响。另外，糖皮质激素容易引起消化系统并发症及某些精神病症状，例如神经性过敏、失眠等[4-10]。目前鲜有文献报道婴幼儿配方乳粉中地塞米松的检测方法。孙清荣等[11]采用液相色谱串联质谱法同时检测鸡肉中的氯霉素和地塞米松；马育松等[12]采用液相色谱－质谱/质谱法测定牛奶和奶粉中地塞米松残留量。本文采用甲酸乙腈溶液提取，固相萃取小柱净化，建立了简便、准确的高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中地塞米松的方法，为我国的婴幼儿配方乳粉的检测提供一定的技术支撑[13-20]。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵均为色谱纯：默克公司；冰乙酸为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；地塞米松标准物质：纯度≥99.0%，德国 Dr.Ehrenstorfer 公司；0.2%甲酸-乙腈溶液：量取乙腈500 mL，加入甲酸2 mL，用乙腈定容至 1 000 mL；Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱：200 mg/6 mL。

1.2 仪器

AB SCIEX 4500 Qtrap 串联四极杆质谱仪：美国AB 公司，配有电喷雾离子源（ESI）；Milli-Q 超纯水器：美国Millipore 公司；PM5-2000TL 型超声波清洗仪：普律玛仪器公司；Vortex－Genie 2 涡旋混匀器：美国Scientific Industries 公司；N－EVAP111 氮气浓缩仪：美国Organomation Associates Jnc 公司；Allegra 64R Cen －trifuge 低温冷冻离心机：美国Beckman 公司，转速不低于12 000 r/min。

1.3 标准储备液和混合标准溶液的配制

分别准确称取10.0 mg 的地塞米松对照品于10 mL容量瓶中，用少量50%乙腈水溶液溶解，再用乙腈定容至刻度，配成浓度为1.0 g/L 的标准储备液，于-20 ℃下保存。

1.4 仪器测定条件

1.4.1 超高效液相色谱条件

Waters XBridge C18 柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；进样量：3 μL；流速：0.3 mL/min。流动相 A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈。梯度洗脱程序：0～1.5 min，10 % B；1.5 min～4 min，10 %～80 % B；4 min～6.8 min，80%B；6.8 min～6.9 min，80%～10%B；6.9 min～8.0 min，10%B。梯度洗脱程序见表1。

1.4.2 质谱条件

离子源：Turbo V ESI 源；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）采集模式；电喷雾电压（IS）：5 000 V；雾化气压力（GS1）：50 psi；辅助气压力（GS2）：50 psi；气帘气压力（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：7 psi；离子源温度（TEM）：450 ℃；质谱分析优化参数见表2。

表1 超高效液相色谱梯度洗脱条件Table 1 Ultrahigh performance liquid chromatography gradient elution conditions

表2 地塞米松的定性离子、定量离子、去簇电压和碰撞能量Table 2 Mass spectrometric parameters of dexamethasone

1.5 样品前处理

1.5.1 提取

称取1 g（精确到0.001 g）试样于 50 mL 塑料离心管内，加入2 mL 水溶解样品，再加入5 mL 0.2%甲酸乙腈溶液，涡旋混匀10 s，超声提取30 min，4 ℃下10 000 r/min 离心10 min，将上清液转移至另一个50 mL离心管内。残渣再按上述步骤提取一次，合并上清液，待净化。

1.5.2 净化

将上述提取液全部过Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱，收集全部流出液，40 ℃氮吹浓缩至近干，用1.0 mL 初始流动相溶液溶解，加入2 mL 正己烷除脂，4 ℃下10 000 r/min 离心5 min，弃去正己烷层，将剩余溶液过0.22 μm 聚四氟乙烯滤膜，高效液相色谱-质谱法测定。

2 结果与分析

2.1 前处理净化柱的选择

分别考察了C18 柱、硅胶柱、Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱的净化效果。试验发现地塞米松在C18、硅胶柱上均有保留，且回收率超过80%，但都需要采用不同的活化溶液和洗脱溶液。而Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱不仅能选择性地吸附奶粉中的磷脂等非极性干扰物同时不吸附目标化合物，其通过式的净化方式能极大地提高样品分析的通量和效率，节约溶剂和时间。经比较，选取Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱为本试验的前处理小柱。

2.2 提取溶液的选择

奶粉样品中含有蛋白质、磷脂等亲脂性杂质以及碳水化合物等，这些杂质都会对目标物的分析造成干扰，且蛋白质和磷脂不易电离，会污染仪器，给奶粉中低含量水平的地塞米松分析带来了挑战。此次试验分别考察了丙酮、乙腈、0.2%甲酸-乙腈、乙酸乙酯溶液作为提取溶液的提取效果，试验结果表明：以0.2%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂时，目标化合物干扰物质少，色谱峰型对称，响应值较高，故选用其作为提取溶液。地塞米松的标准溶液色谱图、空白基质溶液色谱图、空白基质加标溶液色谱图、不同提取溶剂条件下地塞米松的回收率比较图以及地塞米松标准溶液提取离子色谱图，分别见图1、图 2、图3、图 4、图 5 和图6。

图1 地塞米松标准溶液色谱图Fig.1 The chromatogram for dexamethasone standard

图2 奶粉空白基质溶液色谱图Fig.2 Blank matrix solution chromatogram of milk powder

图3 奶粉空白基质加标溶液色谱图Fig.3 Blank matrix of milk powder with standard solution chromatogram

图4 在不同提取溶剂条件下地塞米松的回收率比较Fig.4 Comparison of the recovery of dexamethasone in different solvent extraction conditions

图5 地塞米松标准溶液提取离子色谱图Fig.5 Extracted ion chromatograms of dexamethasone in standard solution

图6 地塞米松标准溶液提取离子色谱图Fig.6 Extracted ion chromatograms of dexamethasone in standard solution

2.3 质谱条件的优化

根据地塞米松的分子结构，质谱离子源的电离模式应采用正离子模式。将100 ng/mL 的目标物标准溶液通过针泵直接注入质谱，以优化喷雾电压、碰撞电压等质谱参数，确定选择表2 所示离子对进行定性、定量分析。

2.4 线性范围和检出限

分别取空白奶粉样品按照1.5 中试验步骤制备空白基质溶液，将标准储备液用空白基质溶液稀释成浓度分别为 0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 ng/mL 的混合标准系列，按照上述色谱条件。以所得峰面积（Y）对质量浓度（C，ng/mL）进行线性回归分析，得到地塞米松的回归方程，见表3。

结果表明，地塞米松在0～20 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.999。采用在空白基质中加标的方法，依据色谱峰的信噪比（S/N）大于3 倍确定检出限（detection limit，LOD），S/N 大于 10 倍确定定量限（Limit of quantitation ，LOQ），得到奶粉中的地塞米松的检出限为 1.0 μg/kg，定量限为 3.0 μg/kg。