针刀松解对坐骨神经痛大鼠中枢腓呔类物质影响研究

张 立，董介轩，殷志荣，石小东，李 皎，许燕飞，董 玮

(云南省中医药大学第三附属医院 骨伤科，云南 昆明 650032)

坐骨神经痛为临床多见周围神经疾病，指坐骨神经或其周围结构病变造成的坐骨神经通路和它所分布范围内出现的疼痛综合征[1]。临床表现有：双下肢放射性疼痛、双腿麻木、双脚麻木且无力等[2]，对患者生活质量影响严重。现代研究表明，坐骨神经痛占全球周围神经疾病患病率的1.2%～43%[3]。该病治疗方法多样，主要分为手术治疗、非手术治疗，疗效不一。在临床工作中针刀松解法用于治疗坐骨神经痛疗效良好，文献报道也肯定了针刀松解治疗坐骨神经痛的疗效[4]。普遍认为针刀松解能减轻局部组织粘连而起到治疗作用，对于针刀松解法对中枢镇痛物质影响报道较少。基于此本实验通过观察针刀松解法治疗坐骨神经痛大鼠后其中枢各部位组织内CCK-8、β-EP、L-ENK表达水平。试探讨针刀松解法对坐骨神经痛大鼠中枢腓呔类物质表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性成熟SD大鼠90只，体重(200g±20g)随机分为对照组、神经损伤组和针刀松解组，每组30只。

1.2 主要试剂及仪器 Leu Enkephalin抗体(abcam公司，货号：Ab85798)；Beta endorphin抗体(Bioss公司，货号：Bs-1195R)；β-Actin抗体(abcam公司，货号：AB6276)；Anti-Rabbit IgG (whole molecule)-Peroxidase antibody抗体(Sigma公司，货号：A6154)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(beyotim公司，货号：P0009-1)；Immobilon Western HRP Substrate Luminol Reagent(Millipore公司，货号：WBKLS0500)；RIPA裂解液(强)(Beyotime公司，货号：P0013B)；二抗孵育试剂盒(中杉金桥公司，货号：PV-9000)；CCK-8放免试剂盒(EB公司，货号：xY-10049)；全自动放免计数仪(西安核仪器厂 ，型号：XH-6020)；放免、免疫组化、Western blotting相关仪器及实验手术相关器械。

1.3 实验方法

1.3.1 造模 对照组10%水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射麻醉后，仅手术不结扎神经。神经损伤组和针刀松解组参照Bennett等[5]方法建立CCI模型： 10%水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射,在消毒条件下,沿大鼠左侧后肢大腿外侧切皮,暴露坐骨神经干,用4号铬制羊肠线环绕神经干分别作4个轻度结扎,结扎间距约1mm,结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动反应为宜,将结扎后坐骨神经放回原位，消毒后间断缝合术口，术毕放回原笼，给正常饲喂。进行行为学观察，行走速度变慢，步幅和频率减小，用嘴反复舔后爪，足趾并拢轻度外翻、自发性的缩足反射等现象，即为造模成功。

1.3.2 针刀松解 针刀松解组：造模成功后于第14、21、28天进行针刀干预。具体操作：对大鼠术侧肢体原术口周围进行触诊，于坐骨神经结扎周围找到条索状物并用龙胆紫定点，每次选1～2个点，常规备皮、消毒，用针刀纵向疏通及横向剥离，出针后以消毒棉签按压针眼孔片刻。每周干预1次，共3周。其余两组不予任何处理，给正常饲喂。

1.3.3 取材 造模成功后35d将各组大鼠处死，分离出延髓、丘脑、海马、腰膨大处脊髓。各部位脑组织及脊髓于冰皿上编号，样品称重记录后置于-70℃保存待测。

1.3.4 CCK-8的检测 以标准管浓度为X轴，以B/T×100% 为Y轴，建立标准曲线。严格按照CCK-8放免试剂盒操作说明检测组织样本，采用全自动放免计数仪进行读值，根据样品检测值以B/T×100%值计算相应样品的浓度结果。

1.3.5 免疫组化测定L-ENK、β-EP 称取组织样本用PBS清洗用4%的多聚甲醛浸泡固定24～48 h，固定好的组织放入100%酒精脱水60 min，将脱水好的组织放入二甲苯中浸泡透明90 min，石蜡浸泡渗透120 min，经石蜡包埋后，将组织块固定在切片机上，切厚度为4 μm的切片，切好后放到50%的酒精中展片，再放到42℃水浴中展片，展平后用阳离子玻片贴片，贴好后放到56℃烘箱中烤片，待石蜡融化后取出玻片放到片盒中。将组织片放入64℃恒温箱中烘烤30 min，经过脱蜡、水化、抗原修复后，给3%H2O2水37℃孵育10 min，阻断过氧化物酶；根据抗体说明书选择合适的稀释比例用PBS稀释一抗，将稀释好后的一抗滴加到玻片上，放到4℃冰箱中过夜，第2天放到37℃温箱中复温30 min,PBS冲洗3次，每次5 min；滴加反应增强液到组织片上，37℃孵育20 min,PBS冲洗3次，每次5 min；滴加试剂盒中的通用二抗在组织块上，37℃孵育30 min,PBS冲洗3次，每次5 min；将组织片进行DAB显色、苏木素复染；染色后的玻片给100%酒精脱水10 min，二甲苯透明10 min；用中性树胶进行封片，使用显微镜在200倍镜下进行拍片。

1.3.6 Western blot检测L-ENK 取1 mL RIPA裂解液，并加入10 μL蛋白酶100×蛋白抑制剂，置于冰上备用，4℃离心机预冷；称取组织样本，按1∶20加入组织裂解液，用组织剪将组织尽量剪碎，冰上裂解15 min，4℃，12 500×g 10 min，取上清，再加入5×SDS蛋白上样缓冲液，于沸水浴中煮10 min,于-20℃保存或直接上样。取0.8 mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20 mg BSA)中，充分溶解后配制成25 mg/mL的蛋白标准溶液。取适量25 mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5 mg/mL。按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min。用酶标仪测定590 nm吸光度。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，分离胶配好后，加异丙醇液封，30 min后弃去异丙醇，用蒸馏水洗10次，用纸吸干水。浓缩胶配好后10 min开始使用。进行120 V电泳到溴酚蓝跑到距离玻璃板下端1 cm位置，进行转膜，转膜后均用5%脱脂牛奶室温封闭30 min。将切下的膜在对应一抗中室温孵育60 min。用TBST洗至无脱脂奶粉。随后室温孵育二抗60 min。二抗浓度使用1∶5 000，二抗孵育完后，TBST洗3次，每次5 min。随后，进行显影。将化学发光底物A液和B液各500 μL混合好，置于避光的盒子中。3 min后，将要显影的PVDF膜用纸吸干多余的TBST后置于裁剪好的保鲜膜上，滴加混合好的化学发光底物，2 min后，用保鲜膜将PVDF膜包好置于暗盒中用透明胶固定好，关灯，根据肉眼看到的荧光效果确定压片时间，时间到后，将片子置于显影液中，待显出条带后，置于蒸馏水中洗片，洗好后再置于定影液中定影，最后再置于蒸馏水中洗片，晾干，做好相应的标记。

2 结果

2.1 大鼠行为学观察 坐骨神经损伤造模后，大鼠行走速度变慢，步幅和频率减小，用嘴反复舔后爪，足趾并拢轻度外翻、自发性的缩足反射等现象，即为造模成功。神经损伤组大鼠30只，造模成功27只，后期感染等其他原因死亡3只；针刀松解组大鼠30只，造模成功26只，后期感染等其他原因死亡6只；对照组大鼠30只假手术后全部存活。

2.2 大鼠中枢各区域CCK-8含量 针刀松解组除延髓各中枢区域CCK-8含量均高于神经损伤组和对照组(P<0.01)，延髓区域针刀松解组高于对照组(P<0.01,见图1) 。

2.3 大鼠中枢各区域L-ENK含量(Western blot检测) 针刀松解组在中枢海马区域明显高于神经损伤组和对照组(P<0.01)。其余中枢区域针刀松解组并未完全高于神经损伤和对照组(见图4)。

**：与对照组比较，P<0.01；ΔΔ：与神经损伤组相比，P<0.01。图1 大鼠中枢各区域CCK-8浓度

2.4 大鼠中枢各区域L-ENK和β-EP含量 针刀松解组在中枢海马区域表达明显高于神经损伤组和对照组(见图2、3)。

图2 在中枢各区域各组大鼠L-ENK表达及定量结果

图3 在中枢各区域各组大鼠β-EP表达及定量结果

海马区域L-ENK/β-Actin灰度比值**：与对照组比较，P<0.01；* ：与神经损伤组相比，P<0.05。图4 在中枢各区域各组大鼠L-ENK表达水平 L-ENK/β-Actin灰度比值

3 讨论

坐骨神经痛是指沿坐骨神经通路及其分布区的疼痛综合征，发病年龄常在20～60岁，其中40岁左右最多见，坐骨神经痛在体内各种神经痛中居于首位。目前坐骨神经痛治疗主要分为手术治疗和非手术治疗；非手术治疗方法中，近年来小针刀治疗坐骨神经痛的报道增多且疗效显著[6]。小针刀自1976朱汉章发明至今，长期用于治疗各种慢性软组织损伤取得良好疗效[7]，有临床报道用于运动损伤也取得良好疗效[8]；但主要认为小针刀具有两方面作用：改善局部微循环[9]；降低局部炎症反应[10]。对针刀松解法对中枢镇痛物质的影响鲜有报道，在临床工作中采用针刀松解法治疗坐骨神经痛，除了能缓解局部症状外，还具有一定的中枢镇痛作用[11]。本实验基于此，采用针刀松解CCI模型大鼠，对大鼠中枢各部位组织内CCK-8、β-EP、L-ENK。以此试探讨针刀松解对坐骨神经痛大鼠中枢腓呔类物质的影响。CCI模型大鼠是一种周围神经损伤导致神经痛的经典模型，其痛觉过敏现象, 症状可持续8周以上[12]。且CCI模型大鼠保留大部分具有传递疼痛作用的C类纤维, 可以很好地模拟出人类临床常见慢性疼痛的症状[13]，故而实验选用CCI模型大鼠进行实验。实验组别设置上，对照组排出手术对检测物质表达影响，神经损伤组与针刀松解组数据比对明确针刀松解治疗效应，针刀松解组与对照组对比观察中枢镇痛物质的表达。

在中枢镇痛机制中，内源性阿片呔的镇痛作用不容忽视。内源性阿片呔包括ENK、β-EP、强腓呔(A(1-13))[14]，本试验检测的L-ENK从属于ENK，主要分布在各级中枢。而阿片呔中以β-EP镇痛能力最强，相当于吗啡镇痛的数十倍，L-ENK镇痛能力相对吗啡较弱[15]。阿片呔的镇痛机制认为是降低c-AMP水平和钙传导[16]，其镇痛作用可以被阿片受体拮抗剂如纳洛酮翻转[17]。本试验采用免疫组化法测定L-ENK、β-EP 针刀松解组在中枢海马区域表达高于神经损伤组及对照组，而其余区域并未表现出高于神经损伤组及对照组(P<0.01)。Western blot检测L-ENK结果与免疫组化结果相似即海马区域针刀松解组LENK表达高于神经损伤组及对照组(P<0.01)。同样作为阿片受体拮抗剂内源性CCK-8，拮抗作用纳洛酮的6000～8000倍，当体内阿片呔物质过多时可引起 CCK-8 生成和释放增多[18]。本实验通过放免检测法检测大鼠中枢各区域CCK-8 针刀松解组除延髓各中枢区域CCK-8均高于神经损伤组和对照组(P<0.01)，延髓区域针刀松解组CCK-8表达高于对照组(P<0.01)。即在治疗过程存在针刀松解组大鼠中枢内啡呔类物质表达水平高于神经损伤组及对照组，而大鼠长期处于疼痛状态体内自发镇痛机制降低大鼠体内腓呔类物质的储存。临床也有报道在长期处于LDH疼痛状态下的患者其体内的腓呔类物质会较正常人偏低[19]。

针刀作为针灸针与手术刀有机的结合体，近年用来治疗坐骨神经痛临床报道有效率高。本实验证明用针刀松解法治疗坐骨神经痛大鼠，除改善局部症状，还能促进中枢腓呔类物质参与内源性镇痛过程。