结肠癌组织Nrf2 和Keap1 表达及其与增殖指数的关系

方帅帅 王 俊

结肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是临床常见疾病。肿瘤细胞常表现为高度的增殖活性[1]。增殖细胞核抗原（PCNA）是细胞增殖的重要标志蛋白，对失控性增殖及增殖活跃的细胞标记效果理想[2]。核因子E2 相关因子2（Nrf2）及其接头蛋白Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）与上皮细胞的恶变有关，对机体环境中的氧化过程及肿瘤细胞的增殖有一定的调节作用[3]。近年研究认为Nrf2/Keap1 是肿瘤发生和进展的通路之一[4]。本研究检测CRC 组织Nrf2 和Keap1 表达，分析其与PCNA 增殖指数的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012 年1 月1 日—2013 年6月10 日期间杭州市第三人民医院确诊为结肠癌的患者96 例作为研究对象，其中男52 例，女44 例，年龄32～89 岁，平均（60.80±6.30）岁。选择术后肿瘤组织作为观察组，选择距肿物边缘＞3cm 的正常结肠黏膜组织作为对照组。标本于术后立即取材，分别留取新鲜组织（-80℃冰箱冻存）和石蜡包埋组织。本研究经医院伦理委员会审核通过，家属签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）确诊后行根治性手术并由病理医师确诊，依据WHO《消化系统肿瘤病理学和遗传学》诊断标准及分型[5]；（2）具有完整的临床及随访资料。排除标准：（1）双原发或多原发癌、林奇综合症的患者；（2）有消化道手术史；（3）术前有放、化疗史。

1.3 方 法

1.3.1 免疫组化法 应用免疫组化二步法检测两组标本组织Nrf2 和Keap1 表达，检测观察组标本组织PCNA 表达。实验基于石蜡包埋组织后切取的4μm切片。三种试剂均购自武汉博士德生物公司，为浓缩液，以50 为不同梯度按不同稀释比例进行预实验，选择显色最佳的浓度用于正式实验（Nrf2 和Keap1均为1:300，PCNA 为1:100）。正式实验由病理科技师操作，DAB 显色，手工染色及显色，严格按说明书进行，做好质控工作。判读由病理医师进行阅片，应用盲法，Nrf2 和Keap1 的显色部位均是细胞质和/或细胞膜，PCNA 的显色部位是细胞核，以淡黄色——棕黄色为阳性。在显微镜下找热点区，共选择5 个400倍视野，以二维进行评分。着色强度：分别以无、弱、中、强计为0、1、2、3 分。阳性判定：分别以＜5%、6%～10%、11%～30%、31%～50%、＞50%为0、1、2、3、4 分。二者之和为总分（0～7 分），以≤3 分为阴性，以＞3 分为阳性。计算阳性率。

1.3.2 Western Blot 法 应用术后留取的新鲜冻存组织，检测两组标本组织Nrf2 和Keap1 蛋白半定量表达。具体方法：GAPDH 为内参。取样本加裂解液后，离心，取上清液提取蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度；放入100℃水浴锅内煮5min，配制10%SDA-PAG凝胶，加适量蛋白和Loading Buffer 混合液，电泳，之后将Nrf2、Keap1 蛋白和GAPDH 的胶段切下转移到PVDF 膜上，封闭60min，加入20mL 抗体（Nrf2 和Keap1 均为1:1200）和20mL 一抗稀释液，4℃过夜，次日洗膜，加入二抗，室温1h 后洗膜，用ECL 发光液进行显影。应用Image J V1.47H 软件进行灰度分析，以蛋白与GAPDH 的比值进行分析。

1.3.3 荧光实时定量PCR 法 应用术后留取的新鲜冻存组织，检测两组新鲜组织Nrf2 和Keap1 mRNA表达。扩增程序：95℃5min、95℃20s、67℃25s、95℃22s、60℃35s 时采集荧光。记录Ct 值，通过2-ΔΔCt法计算目的基因和相对表达水平。ΔΔCt=[Ct 目的基因（未知样品）-CtGAPDH（未知样品）]-[Ct 目的基因（校正样品）-CtGAPDH（校正样品）]。严格按实验步骤完成具体操作，并由专业人士指导，做好质控工作。引物由苏州睿赢药物技术有限公司合成。引物序列：GAPDH：上游5＇-GCACAGAGACACGCTACGCTTTA-3＇，下游5＇-TGGCATGAGAAAGGCATAATGCA-3＇；Nrf2：上游5＇-TTCCGGGGACTGACTCCGCTAAG-3＇，下游5＇-GCACACTGAGTTACACTGAGTTC-3＇；Keap1：上游5＇-ATGAACGCCCACTGAGTCGTAG-3＇，下游5＇-GCACGCTGATACACTTTCCCC-3＇。

表1 两组标本组织Nrf2 和Keap1 蛋白阳性率比较[例（%）]

表2 观察组不同临床病理特征Nrf2 和Keap1 阳性率分组[例（%）]

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0 进行统计分析，采用卡方检验、t 检验、Pearson 相关性检验和KM 生存分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组标本组织Nrf2 和Keap1 阳性率比较 观察组标本组织Nrf2 高表达，Keap1 低表达，两组标本组织Nrf2 和Keap1 阳性率比较，差异有统计学意义（P 均＜0.01）。见表1、插页图1-4。

图1 正常结肠黏膜组织Nrf2 阴性表达（免疫组化二步法×200）

图2 正常结肠黏膜组织Keap1 阳性表达（免疫组化二步法×200）

图3 结肠癌组织Nrf2 阳性表达（免疫组化二步法×200）

图4 结肠癌组织Keap1 阴性表达（免疫组化二步法×200）

2.2 观察组不同特征分组标本组织Nrf2 和Keap1阳性率比较 观察组标本组织Nrf2 和Keap1 阳性率在不同肿物最大径、淋巴结转移、远处转移、浸润深度和TNM 分期亚组的表达差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），Nrf2 和Keap 在不同性别、年龄和分化程度的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 观察组Nrf2 和Keap1 表达与生存时间的相关性 观察组随访时间6～60 个月，平均34.30 个月，经生存分析显示，观察组Nrf2 和Keap1 表达与生存时间相关，即Nrf2 高表达，Keap1 低表达患者的生存时间短。见插页图5-6。

图5 结肠癌组织Nrf2 表达的生存分析

图6 结肠癌组织Keap1 表达的生存分析

2.4 观察组Nrf2 和Keap1 表达与PCNA 增殖指数的相关性 相关分析显示，Nrf2 表达和PCNA 增殖指数具有正相关性（r=0.52，P=0.011）；Keap1 表达和PCNA 增殖指数具有负相关性（r=-0.51，P=0.035）。

2.5 Wesern Blot 检测两组Nrf2 和Keap1 半定量表达 观察组标本组织Nrf2 蛋白平均半定量表达（1.01±0.13），对照组标本组织Nrf2 蛋白平均半定量表达（0.49±0.11），经统计学分析，差异有统计学意义（t=12.31，P＜0.01）。观察组标本组织Keap1 蛋白平均半定量表达（0.59±0.15），对照组标本组织Keap1 蛋白平均半定量表达（1.08±0.10），经统计学分析，差异有统计学意义（t=10.59，P＜0.01）。见插页图7。

图7 Wesern Blot 检测结肠腺癌和正常结肠黏膜Nrf2 和Keap1 半定量表达

2.6 荧光PCR 法检测两组Nrf2 和Keap1 mRNA 比较 观察组标本组织Nrf2 mRNA 平均半定量表达（1.01±0.21），对照组标本组织Nrf2 mRNA 平均半定量表达（0.82±0.19），经统计学分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组标本组织Keap1 mRNA 平均半定量表达（0.83±0.15），对照组标本组织Keap1 mRNA 平均半定量表达（1.20±0.25），经统计学分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。见插页图8-9。

图8 结肠癌和正常结肠黏膜组织Nrf2 mRNA 表达

图9 结肠癌和正常结肠黏膜组织Keap1 mRNA 表达

3 讨论

结肠癌（CRC）与腺上皮的恶性改变有关，遗传学是病变核心。在致癌因素的作用下引起腺上皮的异型增生，细胞的分布及形态结构出现明显改变[5]。病变发展过程中伴随着高度的增殖状态，其中标记增殖最经典的指标是PCNA，其表达于细胞核，能真实客观反应结肠癌细胞的增殖程度[6]。研究认为，PCNA 可以作为临床判断肿瘤预后的重要指标，同时也是细胞去分化的重要标志蛋白[7]。CRC 病理形态中以浸润肌层为重要特征，因此其侵袭能力强，转移潜能高。Nrf2 在正常机体中低表达，对防止异源性因子对DNA 的破坏有重要作用。肿瘤性因素的作用下，Nrf2 高表达，使抑制致癌物活化，加速细胞癌变。Keap1 是多区域阻遏抑制性蛋白，Nrf2 蛋白对Keap1有重要的调控作用，其可能是Nrf2 和Keap1 通路的开关因子。研究显示，Nrf2 和Keap1 定位于细胞浆中，在泛素酶的介导下，使Nrf2 降解加速[8]。肿瘤细胞处于氧化状态时，Nrf2 和Keap1 能引起Nrf2 结构发生解离，细胞内Nrf2 蛋白水平升高并转移到细胞核内，并与抗氧化反应的分子相结合，激活靶基因。Nrf2 和Keap1 能形成强力的聚合体，可以作为Cullin结构中依赖的E3 泛素连接酶复合物的基板，对调节细胞增殖和细胞迁移有一定作用。Keap1 的DGR 区有重复的结构域，能与Nrf2 的DLG 结构区域相结合，对泛素酶进行有效转移，加速蛋白酶体的降解。此时Nrf2 由于不被降解，引起Keap1 的过度饱和，形成新的Nrf2 聚集区，并有效的调动机体的细胞保护因子。Nrf2 和Keap1 可能是内源性抗氧化和自由基形成的因子，Nrf2 和Keap1 的表达可以调节细胞的炎症反应及肿瘤性改变[9-10]。在肺癌和乳腺癌中发现Nrf2 和Keap1 的异常表达，其侵袭和转移能力明显增强，认识到其不仅与生物学进展相关，其还可能是重要的诊断因子和治疗的靶点[11]。

本研究结果显示，结肠癌组织Nrf2 和Keap1 异常表达，提示Nrf2 高表达和Keap1 低表达是促进肿瘤形成的重要的蛋白因素，Nrf2 和Keap1 蛋白表达和mRNA 表达具有明确的一致性。结肠癌组织Nrf2和Keap1 阳性率在不同肿物最大径、浸润深度中的表达差异有统计学意义，提示二者异常表达可以促进肿瘤的生长、局部侵袭和直接蔓延。Nrf2 和Keap1的异常表达与淋巴结转移和远处转移有关，提示二者可能是促进肿瘤细胞迁移的重要因素。Nrf2 和Keap1 表达与TNM 分期有关，提示Nrf2 和Keap1 对判断临床分期可能有辅助意义，由于TNM 分期与肿瘤的生物学进展及判断肿瘤的预后有关，因此Nrf2高表达和Keap1 低表达可能提示预后不良，生存分析的结果证实Nrf2 高表达、Keap1 低表达的患者预后差，与Nrf2、Keap1 与TNM 分期的关联性结论一致。结果显示，CRC 中Nrf2 和PCNA 具有正相关性，Keap1 和PCNA 具有负相关性，提示Nrf2 和Keap1均与PCNA 的表达具有协同作用，二者异常表达时可以促进肿瘤细胞的增殖，使细胞的增殖速度增加，细胞体积增大，细胞生长活跃[12-13]。Nrf2 和Keap1不仅在组织分化和器官的形成中可能有一定作用，还在正常组织的成熟中有一定价值，Nrf2 和Keap1异常表达可以调控多种促癌基因的表达，激活相关癌基因，如肿瘤坏死因子、Mum-1 等[14]。Nrf2 和Keap1还能作为E2F/Rb 的靶向因子，引起肿瘤细胞的异质性改变。Nrf2/Keap1 作为信号通路可以介导多种信号途径，活化核因子等相关细胞分子病理通路，对肿瘤的迁移和血液供应进行有效调控[15]。Nrf2 和Keap1可能对TWIST 等上皮间质转化的因子具有一定的调控作用，这可能是肿瘤进展中的促进因素。近年关注Nrf2/Keap1 在肿瘤治疗靶点及治疗干预作用，后续的临床意义可能更明显[16-17]。

总之，Nrf2 高表达、Keap1 低表达在CRC 的形成和进展有重要作用。Nrf2/Keap1 可能通过对细胞增殖的调节起协同作用，术后检测肿瘤组织Nrf2 和Keap1 表达对判断预后具有一定价值。