三黄益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织IGF-1表达的影响❋

路菲菲，王元松，吕树泉，苏秀海

(1. 河北中医学院研究生学院， 石家庄 050200； 2. 河北中医学院附属河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061001)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)最常见的微血管并发症，也是导致终末期肾病(ESRD)最常见的病因[1]。早期肾脏病变具有可逆性，一旦进入显性蛋白尿期，其病变即为不可逆，患者不得不接受透析甚至肾移植治疗，所以如何采取有效措施抑制DN的进展成为目前的研究重点[2-3]。

前期临床研究发现,三黄益肾胶囊可明显减少早期糖尿病肾病患者尿蛋白，改善患者症状[4]。动物实验发现,该中成药可能通过影响TGF-β1、VEGF[5]、MMP-9、TNF-α[6]、NO、NOS[7]等在肾脏的表达，发挥对糖尿病肾病的保护作用。研究表明，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)参与糖尿病肾病的发生发展过程[8]。本研究通过建立糖尿病肾病大鼠模型，旨在探讨三黄益肾胶囊对IGF-1表达的影响及可能的作用机制，为临床应用进一步提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

三黄益肾胶囊组成:黄芪、西洋参、山药、山茱萸、菟丝子、黄精、地黄、芡实、金樱子、益母草、丹参、川芎、苍术、赤芍、王不留行，为河北省沧州中西医结合医院院内制剂(冀药制字Z 20050795)；雷米普利片由昆山龙灯瑞迪制药有限公司生产(批号H 20030725)。

1.2 动物

70只健康清洁级雄性SD大鼠，体质量(250±50) g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供(动物合格证号11401300065459)。

1.3 试剂和仪器

链脲佐菌素(STZ)、柠檬酸钠(美国sigma公司)；Trizol(Invitrogen)；氯仿、异丙醇、无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)；DEPC水(北京索莱宝科技有限公司)；TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green，天根生物科技有限公司)。显微镜、CMOS(日本奥林巴斯)；多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics公司)；石蜡切片机(德国莱卡RM 2015)；离心机(德国Eppendorf-5430)；低温冰箱(日本三洋MDF-382 E型)；恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)；生物分光光度计(Eppendorf)、罗氏活力型血糖仪(德国罗氏)。

1.4 方法

70只大鼠适应性喂养1周，随机取10只大鼠作为正常对照组(NC)，余60只作为造模组。造模前禁食10 h，一次性腹腔注射链脲佐菌素60 mg/kg(STZ临用前溶于0.1 mmol/L，pH4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中)，NC组腹腔注射等容量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。造模组72 h后尾静脉取血测血糖,血糖值≥16.65 mmol/L作为DN大鼠成模标准[9]。稳定1周后，从造模成功的54只大鼠中随机抽取50只分为糖尿病肾病组(DN)、三黄益肾低剂量组(SL)、三黄益肾中剂量组(SM)、三黄益肾高剂量组(SH)、雷米普利组(RP)每组各10只。SL组、SM组、SH组大鼠分别给予三黄益肾胶囊0.4 g/kg/d、0.8 g/kg/d、1.6 g/kg/d灌胃，RP组大鼠给予雷米普利片0.5 mg/kg/d灌胃,NC组、DN组大鼠给予等剂量蒸馏水灌胃，连续灌胃8周。观察过程中，死亡10只，最终成功纳入结果分析的为50只。

1.5 指标检测及方法

1.5.1 生化指标 治疗8周末将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，用3%戊巴比妥80 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。腹主动脉采血，采集血液后将大鼠处死，将采集血液在离心机上高速离心3000 r/min，持续15 min，收集上清液，采用全自动生化分析仪进行血甘油三酯(TG)、血胆固醇(TC)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)检测。24 h尿微量白蛋白水平的测定应用免疫透射比浊法。

1.5.2 HE染色法观察大鼠肾组织结构 大鼠取血后摘取双肾，并去除肾包膜、肾门结缔组织，用生理盐水洗净后置于4%中性多聚甲醛液中固定，石蜡包埋、切片并行HE染色。具体步骤如下：二甲苯脱蜡(10’)→无水乙醇洗去二甲苯(1’×2次)→95%酒精(1’)→90%酒精(1’)→85%酒精(1’)→自来水洗(2’)→苏木精染色(1-5’)→自来水洗(1’)→1%盐酸酒精分化20 s→自来水洗(1’)→稀氨水(1%)反蓝30 s→自来水或蒸馏水洗(1’)→伊红染色(20 s-5 min)→自来水洗(30 s)→85%酒精脱水(20 s)→90%酒精脱水(30 s)→95%酒精(1’)→95%酒精(1’)→100%酒精(2’)→100%酒精(2’)→二甲苯(2’)→中性树胶封片，光学显微镜下观察大鼠肾组织结构的变化。

1.5.3 免疫组化 采用免疫组化法检测肾组织中IGF-1的表达：大鼠取血后摘取双肾，并去除肾包膜、肾门结缔组织，用生理盐水洗净后取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm组织块；固定于4%多聚甲醛，经70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇30 min 2次，95%乙醇30 min 2次，100%乙醇30 min 2次，二甲苯透明30 min 2次，55 ℃石蜡中30 min 2次，用铜制模具包埋组织块；将组织切片，厚度为3～5 μm，附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60 ℃烘烤过夜；将切片浸于二甲苯中5 min 2次，100%乙醇5 min 2次，95%乙醇5 min 2次，90%乙醇5 min 2次，85%乙醇5 min 2次，75%乙醇5 min 2次，自来水冲洗PBS洗 2次；1%甲醇双氧水，室温10 min，蒸馏水洗1次，0.1 MPBS洗3次×5 min；0.01 M柠檬酸盐缓冲液中放入切片，在微波炉内微波辐射10 min，待修复液降至室温后，0.1 MPBS洗3次×5 min；切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体不洗；切片上滴加一抗，4 ℃过夜，0.1 MPBS洗3次×5 min；切片上滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 MPBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，0.1 MPBS洗3次×5 min；使用DAB显色试剂盒1 ml蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀加到标本上，显色6 min后充分水洗；苏木素复染细胞核1 min充分水洗，1%盐酸酒精分化，1%胺水反蓝充分水洗，经70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2次，95%乙醇5 min 2次，100%乙醇5 min 2次脱水，二甲苯透明5 min 2次，中性树脂封片；选择对照组和实验组的阴性和阳性组织相进行显微照相，倍数为400×。

IGF-1阳性表达为出现棕黄色颗粒，强度大于非特异性背景为准。结果判断参考文献[10],按照染色深度和阳性细胞数占总细胞数的比例进行分级评分。A为阳性细胞数分级0～1%=0、1～10%=1、10～50%=2、50～80%=3、80～100%=4、B为阳性细胞显色强度分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)，IHS=A×B。

1.5.4 实时荧光定量PCR法检测大鼠肾组织IGF-1mRNA的表达 (1)提取样本总RNA：用Trizol提取组织样本中总RNA，步骤如下：用研钵研磨组织样品，在加有1 ml Trizol的离心管中静置5～10 min；加入0.2 ml氯仿进行15～30 s的上下剧烈混匀，然后冰浴静置3 min；4 ℃ 12000 rpm离心15 min；将水相加至新的EP管中，然后加入0.5 ml异丙醇使其混匀，冰浴10 min；4 ℃ 12000 rpm离心10 min；将上层液体倒出，用75%冰乙醇沉淀使其混匀，4 ℃ 12000 rpm离心5 min干燥。加入DEPC处理水使RNA溶解，然后检测浓度，-80 ℃保存。

(2)反转录：采用TIANScript RT KIT进行反转录，按产品说明书进行步骤操作，首先向反应管中加入如下所示50 μL反应体系的第一部分，使其混匀。试剂50 μL反应体系，总RNA1 μg，Oligo(dT)2 μL，Super Pure dNTP2 μL，RNase-Free ddH2O定容至14.5 μL。然后70 ℃加热5 min后，迅速在冰上冷却2 min，简短离心收集反应液后加入如下所示的各组分：试剂50 μL反应体系，混合物14.5 μL，5 xFirst-StrandBuffer0.5 μL，RNasin0.5 μL，TIANScrip M-MLV1 μL。轻轻吸打混匀后进行10 min的25 ℃温浴，50 min的42 ℃温浴，然后用95 ℃的温度加热5 min。最后用RNase-Free ddH2O将反应体系稀释至50 μL，-20 ℃保存。

(3)实时荧光定量PCR

引物设计

反应体系：按照产品说明书操作实验,试剂20 μL反应体系,2*SuperReal PreMix Plus 10 μL,上游引物(10 μM) 0.6 μL,下游引物(10 μM) 0.6 μL,cDNA 100 ng,50*ROX Reference Dye△ 0.4 μL,RNase-Free ddH2O至20 μL。

反应程序

结果分析:用荧光定量PCR仪，用2-△△Ct法进行分析，参照正常对照组的目的基因表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 生化指标检测结果

表1显示，与NC组大鼠比较,DN组大鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白均升高(P<0.05)；与DN组大鼠比较,SM组、SH组、RP组大鼠肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组大鼠肾组织光镜下变化

图1显示，NC组大鼠肾组织结构正常，肾小球大小正常，未见肾小球基底膜增厚，也无系膜基质增生，肾间质无浸润的炎性细胞；DN组大鼠肾组织结构呈现混乱状态，可见增大的肾小球体积和增生的系膜基质，还可见一些空泡样变性，其部位在部分肾小管上皮细胞上，肾间质有浸润的炎性细胞；与NC组大鼠比较，各造模组大鼠肾脏体积变大明显，与DN组大鼠比较，各治疗组大鼠肾脏体积略小于DN组大鼠肾脏体积。SM组、SH组大鼠的病理结构改变相似，其病理改变程度均较DN组大鼠减轻，可见轻度肥大的肾小球、轻度增厚、增生的基底膜及系膜基质肾间质没有明显浸润的炎性细胞；SL组大鼠病理改变较SM组、SH组大鼠重，肾小球、肾小管和肾间质病变程度略优于DN组大鼠。RP组大鼠肾小球未见明显肥大，其结构较清晰，未见明显增生的系膜基质，肾间质未见明显浸润的炎性细胞。

2.3 免疫组化、实时荧光定量PCR法检测肾组织IGF-1蛋白、基因表达

图2表2显示，IGF-1在肾小球、肾小管细胞中表达，免疫组化结果显示,与NC组比较DN组IGF-1表达增强(P<0.05)，与DN组比较SM组、SH组、RP组表达减弱(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示，与NC组比较DN组IGF-1mRNA升高(P<0.05)，与DN组比较SL组、SM组、SH组、RP组降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白水平变化比较

注：与NC组比较：*P<0.05；与DN组比较：#P<0.05

图1 各组大鼠肾组织病理改变(HE×400)

组别鼠数IGF-1IGF-1mRNANC60.15±0.061.13±0.22DN60.92±0.22∗23.27±1.78∗SL60.70±0.04∗10.93±1.09∗#SM60.50±0.02∗#5.39±0.64∗#SH60.48±0.06∗#8.10±1.19∗#RP60.43±0.04∗#2.48±0.69∗#

注：与NC组比较：*P<0.05；与DN组比较：#P<0.05

图2 免疫组化法检测各组大鼠肾组织IGF-1蛋白表达(×400)

3 讨论

近年来，DN的发病率呈升高趋势，我国约有20～40%的糖尿病患者并发此病[11]。DN的病理改变主要为肾小球细胞外基质堆积、系膜增宽、基底膜增厚，继而发展为肾小球硬化病变。研究表明，IGF-1可以通过内分泌、旁分泌等形式在细胞的分化、增殖、生长发育中发挥重要促进作用[12-13]。IGF-1是一种能够促进细胞生长、具有胰岛素样代谢效应的细胞因子，与DN病变密切相关。IGF-1有胰岛素样作用，能促进葡萄糖在细胞内的运输，使系膜细胞对葡萄糖的摄取增加，促进系膜细胞的代偿性增生，刺激系膜细胞合成蛋白而致细胞外基质堆积，使肾小球硬化加速[14]。在高浓度葡萄糖环境下，IGF-1可以导致肾小球血流动力学改变[15]，一氧化氮(NO)在DN肾组织中血流动力学改变、细胞外基质的形成起着重要作用，而IGF-1能促进NO的产生。在DN中，高血糖可以导致肾小球系膜细胞损伤，进而使肾脏局部IGF-1旁分泌合成增多、降解减少，最终导致肾脏IGF-1水平升高[16]。由此可知，IGF-1在DN进展中起着重要作用。本研究结果显示，SM组、SH组大鼠肾组织中IGF-1蛋白及IGF-1mRNA较DN组降低，说明IGF-1可能是三黄益肾胶囊改善DN肾功能分子机制中的重要通路。

DN基本病机为本虚标实，脾肾亏虚为本、血瘀为标。三黄益肾胶囊以益气养阴、活血化瘀固精为主要功效，由黄芪、西洋参、山药、山茱萸、菟丝子、黄精、地黄、芡实、金樱子、益母草、丹参、川芎、苍术、赤芍、王不留行组成，临床观察对早期DN疗效肯定[17]。现代药理研究表明，黄芪有利尿、消除蛋白尿、保护肾小管的作用，黄精有提高机体免疫功能、抑制血糖过高、保护肾脏的作用，生地黄有强心、利尿、改善肾功能的作用，西洋参有抗疲劳、降血糖、抗利尿作用，山药、山茱萸有降糖、抗氧化作用，益母草有利尿、改善肾功能作用，丹参有改善肾功能作用，川芎有改善微循环、抑制血小板凝集作用，王不留行有减轻氧化应激作用，赤芍有改善早期肾功能作用，金樱子、芡实有保护肾功能作用，菟丝子有抗氧化、免疫调节等作用，苍术有降糖等作用，诸药联用共奏益气养阴、活血化瘀固精之功。

本研究结果显示，三黄益肾胶囊中、高剂量组能降低肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白水平，改善肾组织病理学变化，其机制可能与三黄益肾胶囊调节IGF-1表达，从而改善糖尿病肾病大鼠肾功能有关，此可能是三黄益肾胶囊治疗DN的另一有效作用机制。