基于网络药理学探讨鹿茸对肾细胞癌的作用机理

吴玲玲　高宏君　蒋鹏　武桢　周杰彬

【摘  要】目的：利用网络药理学探讨鹿茸治疗肾细胞癌的作用机理。方法：通过网络药理学分析平台（BATMAN-TCM）数据库筛选鹿茸所对应的靶标基因，通过GeneCards数据库筛选肾细胞癌的靶标基因，通过Venny2.1数据庫获得鹿茸对肾细胞癌的相关靶点，利用STRING数据库进行蛋白互作网络分析，利用 David6.8数据库进行GO分析和KEGG信号通路富集分析。结果：从鹿茸中筛选获得包括17-β-雌二醇、氨基葡萄糖、三磷酸腺苷、视黄醇等14 个化学成分及 303 个靶点。鹿茸作用于肾细胞癌的靶点有20个，主要靶点包括连环蛋白β1、转化生长因子β1、肿瘤坏死因子、干扰素γ、雌激素受体1、基质金属蛋白酶9、趋化因子受体等。利用 David6.8数据库进行GO分析得到143个生物学过程，13个细胞组成，26个分子功能，通过 KEGG 分析富集得到34条通路。结论： 本研究基于网络药理学分析得出鹿茸的有效化学成分，初步预测了鹿茸作用于肾细胞癌的靶点并初步揭示了鹿茸对肾细胞癌的作用机制，为肾细胞癌的治疗提供了更多可能。

【关键词】鹿茸;肾细胞癌;网络药理学;作用机理

【中图分类号】R29      【文献标志码】A      【文章编号】1004-7484（2020）09-0268-02

肾细胞癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，又称肾癌、腺癌，大多数肾癌是透明细胞癌。肾细胞癌是肾脏最为常见的肿瘤，约占肾肿瘤总数的75%-80%，约占全部成人恶性肿瘤的2% ～3%，发病年龄多在40-60岁。肾细胞癌发展到晚期，会转移至肺部及骨骼。

鹿茸是一种名贵的中药材，其表面覆盖毛发，内部由结缔组织、软骨、血管与大量神经纤维组成。鹿茸首于 《神农本草经》 ，列为中品，其性温，味甘、咸，归肝、肾经，具有壮肾阳、益精血、强筋骨等功效。鹿茸是唯一能够完全再生的哺乳动物组织。《本草纲目》记载，鹿茸具有治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、神疲、畏寒、眩晕、耳鸣、耳聋、等功效。中药成分具有“多成分、多靶点”的特点，而网络药理学研究药物系统性、整体性的特点，与中医药辨证论治的原则不谋而合。

1.材料

STRING数据库、BATMAN-TCM数据库、GeneCards 、Venny2.1工具、David 6.8数据库、GraphPad Prism 7.0 软件、OmicShare数据库等。

2.方法

2.1鹿茸的化学成分收集与靶点预测

利用中药分子机制生物信息学分析平台BATMAN-TCM 挖掘鹿茸的化学成分，通过该服务器的 “成分-靶点相似性”原理，设置阀值 “Score cutoff =30”，计算化学成分对应的潜在靶点。

2.2肾细胞癌潜在作用靶点的筛选

在GeneCards数据库中，检索肾细胞癌相关靶点，输入“renal cell carcinoma”，按“Relevance score”排序取前200 个靶点作为肾细胞癌疾病的候选靶点。

2.3鹿茸靶点与肾细胞癌靶点关联分析

利用Venny2.1工具将鹿茸的化学成分靶点导入到“List1”，将肾细胞癌相关靶点导入到“List2”中进行交集比对，最终获得鹿茸对肾细胞癌的相关靶点。

2.4靶点相互作用网络图的构建与分析

利用STRING数据库平台构建靶点蛋白互作网络，设置物种为“Homo sapiens”进行操作，将最低相互作用阀值设为中等“medium confidence = 0. 4 ”。

2.5 GO生物过程富集

在David 6.8数据库中，依次选择 “OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、“Gene list”、“Submit list”，修改背景为“人类”，选择“Gene Ontology”，分别勾选“生物过程” 、“分子功能 ”、“细胞成分” ，将得到的数据导入GraphPad Prism 7.0 软件进行GO分析，得到鹿茸对肾细胞癌作用靶点的GO分析结果。

2.6 KEGG信号通路分析

在David6.8数据库中，依次选择“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、“Gene list”、“Submit list”，修改背景为“人类”，选择“Pathway-KEGG”，将得到的数据导入到OmicShare数据库中进行KEGG分析，得到鹿茸对肾细胞癌作用靶点的KEGG分析的气泡图。

3.结果分析

3.1鹿茸的化学成分收集与靶点预测

利用BATMAN-TCM数据库共挖掘到鹿茸有效化学成分14个（如表1），对应的潜在靶点363个，经删除重复项后得到303个潜在靶点，其中包括ABAT、BCL3、COX1、DAO、ESR1、FABP6等。

3.2肾细胞癌相关靶点的筛选

在GeneCards数据库中，检索肾细胞癌相关靶点，输入“renal cell carcinoma”共得到7776个相关基因，按“Relevance score”排序取前200 个靶点作为肾细胞癌疾病的候选靶点，见表2（仅列出relevance score前10 个）。

3.3鹿茸靶点与肾细胞癌靶点关联分析

利用Venny 2.1工具将鹿茸靶点与肾细胞癌靶点关联分析，最终获得20相交靶点，包括CTNNB1、TGFB1、TNF、 IFNG 、ESR1 、SLC2A1 、MMP9 、CXCR4等。

3.4靶点相互作用网络图的构建与分析

将鹿茸靶点与肾细胞癌靶点关联分析获得的20个相交靶点导入到STRING数据库中，获取蛋白质相互作用关系，并得出各靶点间相互作用的网络图，结果如图1所示。其中“节点”代表作用靶点，“边”代表各靶点之间的相互关联，其“粗细”用“combine score” 表示，边越粗，combine score值越大，代表其结合度越大。由图可知，共有20个节点、83条边，平均节点度为8.3，平均局部聚类系数为0.744。

3.5 GO生物过程富集

利用 David 6.8数据库将鹿茸作用于肾细胞癌的20个靶点进行 GO 分析，从生物学过程、细胞组成、分子功能对20个关键靶点进行分类分析，分别得到170、16、33条，P<0. 05 者分别为143、13、26 条。其中生物学过程包括药物反应、一氧化氮生物合成的正调节、RNA聚合酶II启动子转录的正调节、RNA聚合酶II启动子转录的负调节;细胞组成包括等离子体膜、细胞表面、蛋白质复合体、细胞外区域等;分子功能包括酶结合、类固醇激素受体的活动、类固醇结合、相同的蛋白结合等。

3.6 KEGG 信号通路分析

利用 David 数据库进行KEGG信号通路富集，共得到42条信号通路，P<0.05 者有34条，其中包括癌症通路、肾细胞癌、破骨细胞分化、MAPK信号通路、癌蛋白聚糖等。

4.讨论

本文通过對鹿茸“成分-关键靶点-通路”的网络进行分析，发现了鹿茸 14 个化学成分及303个潜在靶点，将鹿茸靶点与糖尿病肾病靶点进行关联性分析得到20个相交靶点。已有文献表明，三磷酸腺苷在抗人食管癌细胞增殖方面有较强的作用，LRAT和RDH12是视黄醇代谢相关基因，对宫颈鳞癌细胞具有抑制效果，氨基葡萄糖具有抗肿瘤和增强免疫的功能。根据网络分析结果，推测鹿茸可能通过作用于视黄醇X受体RXRA从而影响癌症信号通路发挥药效。故三磷酸腺苷、视黄醇和氨基葡萄糖可能是鹿茸潜在的抗肿瘤成分，并通过癌症通路等信号通路发挥抗肿瘤的作用。研究发现17-β-雌二醇对MHCC97H肝癌细胞的侵袭具有有效的抑制作用;研究表明注射前列腺素E17d对肿瘤有抑制作用。网络分析结果显示鹿茸中17-β-雌二醇、前列腺素E1能够作用到ESR1、ESR2关键靶点，推测鹿茸可能通过作用于这些靶点从而影响癌蛋白多糖等信号通路发挥药效。综合文献及网络分析结果，证明鹿茸在治疗肿瘤疾病方面具有潜在的优势。然后，对鹿茸作用于肾癌的主要的20个靶点进行DAVID分析得到生物学过程、细胞组成、分子功能等相关信息。

P<0.05 的生物过程有143个，包括药物反应、一氧化氮生物合成的正调节、RNA聚合酶II启动子转录的正调节、RNA聚合酶II启动子转录的负调节等。主要涉及氧化应激、抗炎、抗氧化等方面。有研究表明，经高镁培养基培养的内皮细胞中NO产生增加，可防止NF-κB活化，降低基质金属蛋白酶9（MMP-9）活性。研究表明，MMP-9蛋白的表达对肿瘤的分化程度、侵袭与转移有影响，故推测一氧化氮生物合成的正调节与肾癌的方式密切相关。P<0.05 的分子功能有26个，包括蛋白结合、酶结合、类固醇结合等。蛋白结合是指药物进入血液循环与血浆蛋白结合，成为结合型药物，暂时失去一般药理活性，并 “储存”在血液中。一般蛋白结合率高的药物体内消除较慢，作用时间长。P<0.05 的细胞组成有13个，包括蛋白质复合体、胞外区、胞核、胞质、细胞外间隙等。

对鹿茸作用于肾癌的主要的20个靶点进行KEGG 通路富集分析，得到 P<0. 05 的通路34条。其中HIF-1信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路等与肾癌有关。HIF-1是一类转录因子，可调控细胞内环境的稳态。在正常条件下，HIF-1处于不稳定状态，通过VHL介导的泛素化降解;在缺氧条件下，HIF-1处于稳定状态，可激活相关靶基因的转录和表达，导致细胞发生损伤、增殖、凋亡、侵袭、转移等一系列过程。相关研究发现，在肾癌的发生和发展过程中VHL/HIF信号通路起着十分重要的作用。研究发现，通过抑制VHL/HIF信号通路，肾癌细胞增殖活性降低，侵袭和转移能力减弱。TGF-β是肿瘤微环境中的重要成分之一，可由肿瘤细胞及间质细胞等多种成分分泌。TGF-β与其受体结合后可通过Smad依赖或非依赖方式介导信号转导，调控肿瘤侵袭转移。有研究表明，TGF-β在肾癌等肿瘤具有较高的表达水平，且血清与尿中的TGF-β水平与肾癌患者预后呈负相关。有多项研究指出，在大肠癌，乳腺癌，肾癌，前列腺癌症患者中，血清或者肿瘤组织 TGF-β水平明显高于正常人。 MAPK信号通路能介导如炎性细胞因子、细菌产物、物理、化学应激等刺激引起的细胞反应，可参与多种生理过程，如细胞形成、运动、凋亡、分化及生长增殖等。MAPK途径被称为蛋白激酶的级联，与多种恶性肿瘤的发生密切相关。有研究表明，MAPK信号通路可能参与肾细胞癌进展过程中的增殖和转移过程中miR-106b/CIC轴的调控。

综上所述，鹿茸治疗肾细胞癌的有效成分主要包括三磷酸腺苷、氨基葡萄糖、17-β-雌二醇、前列腺素 E1等，鹿茸可能主要通过抗氧化、抗炎、抑制细胞生长等方面来治疗肾细胞癌。本研究基于网络药理学分析获得鹿茸治疗肾细胞癌的可能有效成分及潜在作用靶点，但本研究仅为预测分析，上述有关结论及具体作用机制还有待后续研究加以论证，不断完善。

参考文献

[1]陈宁，全科医生临床诊疗手册，中国医药科技出版社，2016.06，第201页

[2]黄辑.神农本草经[M].北京： 中国古籍出版社，1982：222.

[3]李春义.鹿茸完全再生机制研究进展[J].农业生物技术学报，2017，25（01）：1-10.

作者简介：

吴玲玲（1995-），汉，女，广西桂林，硕士在读，研究方向：泌尿外科。

通讯作者：

高宏君（1972-），满，男，吉林长春，博士，主任医师，研究方向：泌尿外科，器官移植。

基金项目：

1.广西自然科学基金面上项目，2017GXNSFAA198080.

2.广西壮族自治区中青年教师基础能力提升项目，2019KY0317.

3.广西中医药大学2018年广西一流学科建设项目重点课题，2018XK085.

4.广西中医药大学2019-2011年广西一流学科建设项目，2019XK173.

5.广西中医药大学2019-2011年广西一流学科建设项目青年基金项目，2019XK176.