细菌超声分散计数仪在结核药敏实验中的生物安全优势

张国斌 沈阳市疾病预防控制中心 （辽宁 沈阳 110031）

内容提要： 目的：评估细菌超声分散计数仪（简称“分散仪”）在结核分枝杆菌药物敏感性试验（简称“药敏试验”）中的生物安全优势。方法：使用分散仪和磨菌瓶两种方法对结核分枝杆菌做药敏试验，操作过程中在安全柜内用FA-2型撞击式空气微生物采样器采集空气，接种中性罗氏培养基，培养后观察菌落生长情况。结果：分散仪操作过程中，空气采样培养后无菌落生长，磨菌瓶操作过程中，空气采样培养后有少量菌落生长。结论：在分枝杆菌药敏试验的菌悬液制备过程中，对比传统磨菌瓶处理方法，分散仪处理能更快、操作时间短，使用菌量更少，静置同样时间开盖后产生气溶胶含菌量低。大大降低了结核药敏试验这种大量活菌操作试验给操作者和环境带来的生物安全隐患，同时不影响菌株的活性和药敏试验结果。

结核分枝杆菌（MTB）的药物敏感性试验（简称“药敏试验”）是耐药结核病诊断的金标准。目前在我国各级结核病诊断实验室中，最常用的耐药检测方法仍然是基于固体培养基培养的比例法和MGIT 960的液体比例法，而菌悬液标本的制备是其关键步骤[1,2]。常用的方法是磨菌瓶法：通过振荡瓶中的玻璃珠与菌落，从而使菌落分散，然后加入含0.5%Tween-80的生理盐水进行稀释，与麦氏1号标准比浊管或比浊仪比浊并稀释至1个麦氏浊度（MCF），经稀释后接种到含药罗氏管进行耐药性检测。上述方法虽然能使菌落分散成菌体，成功完成药敏检测，但存在操作繁锁、耗时长、比浊粗糙，用菌量大，以及生物安全风险等问题。而细菌超声分散计数仪采用超声分散的原理使菌落分散，同时自动检测浊度，最后经人工接种到含药培养管培养进行耐药性检测，具有操作简单、减少开盖次数、标准化，耗时短，用菌量少，减少生物安全风险等优势。本研究分别采用细菌超声分散计数仪（简称“分散仪”）和传统的研磨瓶法制备临床MTB菌株的菌悬液样本，制作过程中采集空气样本培养，以评估分散仪在MTB药敏试验中的生物安全优势。

1.材料与方法

1.1 一般材料

菌株来源：实验中所用的菌株为本实验室耐多药可疑者筛查项目菌株，传代后5周。状态最好时期。

仪器与试剂：①仪器：细菌超声分散计数仪（超声功率为19W；广东体必康生物科技有限公司生产）、37°C恒温培养箱、生物安全柜、FA-2型撞击式空气微生物采样器，微量震荡器。②试剂耗材：磨菌瓶、罗氏中性培养基、接种环、生理盐水、0.5%Tween-80生理盐水、超声分散专用试管。

1.2 方法

磨菌瓶法菌悬液制备：用一次性10μL接种环挑取罗氏培养基内菌落约一环，放入磨菌瓶中，拧紧瓶盖，在震荡器上震荡30s，震荡过程中调整磨菌瓶角度，使玻璃珠在磨菌瓶内转动。震荡后静置15min，静置后开盖加入适量生理盐水（此步骤开始使用FA-2型撞击式空气微生物采样器采集生物安全柜内空气样品），比浊仪比浊，按照比浊仪提示稀释至1MCF（1mg/mL）。结束空气采样，将采样膜处理后，用无菌尼龙拭子涂抹于中性罗氏培养基表面，放入37°C温箱培养。

分散仪法菌悬液制备：用一次性10μL接种环挑取罗氏培养基内菌落约四分之一环，放入预先加有2mL生理盐水的超声分散专用试管中，然后将该试管放入分散仪中进行超声分散：超声5s，间隔5s，持续1min。取出后静置15min，根据仪器提示加入相应体积稀释液（此步骤开始使用FA-2型撞击式空气微生物采样器采集生物安全柜内空气样品），将菌悬液稀释至1MCF（1mg/mL）。结束空气采样，将采样膜处理后，用无菌尼龙拭子涂抹于中性罗氏培养基表面，放入37°C温箱培养。

2.结果

使用磨菌瓶法制备7份菌悬液，用时1h，采样时间20min，接种10支罗氏中性培养基，使用分散仪法制备制备7份菌悬液，用时30min，采样时间20min，接种10支罗氏中性培养基。经过37°C培养8周，结果见表1。

表1. 两种方法制备菌悬液培养基阳性及菌落数比较(n)

3.讨论

人及动物结核病的病原菌是结核分枝杆菌（TB），发病率最高的是以人型结核分枝杆菌，约占百分之九十，接下来接是牛型，其他分枝杆菌所致感染非常少见。近年来国内有不少有关生物安全防护、生物安全管理、防护设备调查的实验室生物安全问题发生，越来越引起人们的重视[3,4]。一般涉及MTB生物安全的文献较少，缺乏相应的实验数据支持，主要为说明操作规范的标准操作程序。难以避免产生气溶胶在日常检测MTB的实验活动中，如痰样本混匀、离心、开启培养皿和安瓿，样本涂片、意外事件如培养物的溅出和泼洒、培养液的倾倒和转移、离心管破碎等都可造成严重污染。主要原因是因为大部分实验室感染人员在处理临床样本和培养物过程中吸入产生的含病原体的气溶胶所致。医务人员存在较高的感染风险，在结核病患者较多活动的医疗卫生单位。结核防治工作人员结核病发病水平显著高于一般人群。长期以来，我国各级实验室通常采用手工磨菌、人工比浊的方法对MTB进行研磨分散与比浊稀释后进行比例法或绝对浓度法的药敏试验。手工磨菌过程容易产生可开放扩散的气溶胶，且研磨过程中存在液体迸溅的风险，即使在生物安全柜内进行磨菌操作，手工磨菌的过程仍然存在较大的生物安全隐患。因此，在传统药敏试验的前期菌悬液制备阶段，通过分散仪来代替传统磨菌瓶研磨处理，处理能力更快、操作时间短，使用菌量更少，静置同样时间开盖后产生气溶胶含菌量低。大大降低了结核药敏试验这种大量活菌操作试验，给操作者和环境带来的生物安全隐患。同时不影响菌株的活性和药敏试验结果[5]。

细菌超声分散计数仪可以用于结核分枝杆菌等微生物药敏试验的菌悬液制备、细菌分离培养的菌落分散及浊度评测、以及菌种鉴定、菌种保藏的样品前处理等。在超声波的作用下，超声分散专用试管中的微小气泡核会产生振动，当声压达到一定值时，气泡将迅速膨胀，然后突然闭合，在气泡闭合时产生冲击波。细菌超声分散计数仪的分散功能就是利用这种超声空化作用，完成对结团性细菌的分散。细菌超声仪利用90°散射光特性，即不论光源波长和待检测细菌直径大小关系如何，在菌液浓度一定时，90°方向上散射光强度保持恒定。再利用光传感器把光信号转化为电信号，最终使菌液浓度以麦氏浊度的方式呈现在系统里。在结核菌的药敏试验中，常规方法受到结核菌成团性以及气溶胶生物安全隐患的影响，在试剂操作中存在着极大的不便，而细菌超声分散仪不仅可以完成菌团的分散，而且对菌液的浓度进行了检测，为实验人员提供了安全、高效和标准化的结核菌操作方案。